發(fā)布時(shí)間：2017-09-15 00:17

  本文關(guān)鍵詞：hOGG1在TNF-α誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化損傷和凋亡中的作用

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【摘要】：視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)位于視網(wǎng)膜的最外層,RPE細(xì)胞對維持正常視網(wǎng)膜功能如吸收散射光線、視色素再生和合成、光感受器的更新和代謝以及構(gòu)成血-視網(wǎng)膜屏障等至關(guān)重要,RPE細(xì)胞的氧化損傷和凋亡在多種視網(wǎng)膜變性類疾病的發(fā)病機(jī)制中起了重要作用。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-a)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),在這些疾病的發(fā)病機(jī)制中起到了媒介作用。TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生更多活性氧(reactive oxygen species, ROS),在眾多ROS攻擊DNA產(chǎn)生的DNA氧化損傷中,鳥嘌呤8位碳原子的氧化最常見,形成8-羥基鳥嘌呤(8-oxoguanine,8-oxodG),它是目前國際上公認(rèn)的一種評價(jià)DNA氧化損傷的敏感指標(biāo)和生物標(biāo)志物。哺乳動物細(xì)胞內(nèi)能夠特異性修復(fù)8-oxodG的酶,被稱為8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶1 (8-oxoguanine DNA glycosylase-1,OGG1),在人體內(nèi)又稱為人8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶(human 8-oxoguanine DNA glycosylase, hOGG1)。hOGG1 (OGG1)是堿基切除修復(fù)途徑(base excision repair, BER)的關(guān)鍵酶。RPE細(xì)胞易受各種因素的攻擊而產(chǎn)生DNA氧化損傷,這些DNA損傷若得不到及時(shí)修復(fù),就可能會誘導(dǎo)RPE細(xì)胞凋亡。最近的研究表明,炎癥因子TNF-α不能引起OGG1低表達(dá)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonal fibroblast cells, MEFs)炎癥反應(yīng)發(fā)生,因此推測hoggl基因可能涉及到TNF-α誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞氧化損傷和凋亡中的作用,我們進(jìn)行了如下研究。研究分三個(gè)部分,主要內(nèi)容如下：第一部分構(gòu)建hOGG1-lα表達(dá)不同的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19模型：鑒定重組腺病毒表達(dá)載體pAd/CMV/V5-DEST-hogg1和陰性對照腺病毒pAd/CMV/V5-GW/lacZ,在人胚腎293A細(xì)胞中包裝腺病毒,并反復(fù)擴(kuò)增病毒,用空斑形成試驗(yàn)測定病毒滴度。pAd/CMV/V5-DEST-hogg1、pAd/CMV/V5-GW/lacZ以30.1的感染復(fù)數(shù)(MOI)分別轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞,采用western blot比較轉(zhuǎn)染重組腺病毒組pAd/CMV/V5-DEST-hogg1的ARPE-19細(xì)胞(RPE-Ad-hogg1)、轉(zhuǎn)染載體pAd/CMV/V5-GW/lacZ的ARPE-19細(xì)胞(RPE-Ad-lacZ)以及未轉(zhuǎn)染的ARPE-19細(xì)胞表達(dá)的hOGG1-la,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染重組腺病毒組ARPE-19細(xì)胞表達(dá)hOGG1明顯高于未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染空腺病毒組,而未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染空腺病毒組的ARPE-19細(xì)胞表達(dá)hOGG1無明顯差別。第二部分觀察過氧化氫(H202)對hOGGl-la表達(dá)不同的ARPE-19細(xì)胞產(chǎn)生ROS和氧化損傷的影響：H202是活性氧自由基ROS家族的成員之一,可以直接損傷細(xì)胞核內(nèi)的核酸引起DNA鏈的氧化損傷,攻擊鳥嘌呤后產(chǎn)生8-oxodG。本研究用20μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L濃度的H202分別作用于ARPE-19細(xì)胞2h后,發(fā)現(xiàn)隨著H202濃度的增加,ARPE-19細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)下降趨勢；其中H202濃度100μmol/L時(shí)ARPE-19細(xì)胞存活率為77.80±4.513%。以100u mol/L H2O2分別作用于hOGGl表達(dá)不同的ARPE-19細(xì)胞2h后,以流式細(xì)胞儀和免疫細(xì)胞化學(xué)法分別檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的生成和形成8-oxodG的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(%),這些結(jié)果表明,H202和腺病毒可以引起ARPE-19細(xì)胞內(nèi)生成ROS和形成8-oxodG的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(%)增加,高表達(dá)的hOGG1減少ARPE-19細(xì)胞內(nèi)ROS的生成和修復(fù)氧化劑H202引起的氧化損傷作用。第三部分觀察TNF-α對hOGGl-la表達(dá)不同的ARPE-19細(xì)胞氧化損傷和凋亡的影響：①以10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL濃度的TNF-α分別干預(yù)hOGG1表達(dá)不同的ARPE-19細(xì)胞12、24、36、48h,用MTT法檢測比較這些細(xì)胞的存活率。結(jié)果顯示：不同濃度的TNF-α干預(yù)ARPE-19細(xì)胞24h內(nèi),隨著TNF-a干預(yù)濃度的增加和時(shí)間的延長,各組ARPE-19細(xì)胞存活率均呈下降的趨勢(P0.05)；相同濃度TNF-α分別干預(yù)各組ARPE-19細(xì)胞36h、48h后與24h相比,細(xì)胞存活率沒有顯著的降低趨勢(P0.05)。在相同濃度TNF-α誘導(dǎo)下,高表達(dá)hOGGl的ARPE-19組細(xì)胞存活率較兩對照組細(xì)胞高(P0.05)。以50ng/mL TNF-a分別干預(yù)hOGG1表達(dá)不同的ARPE-19細(xì)胞24h,用流式細(xì)胞儀和免疫細(xì)胞化學(xué)法分別檢測細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS和形成8-oxodG的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(%),這些結(jié)果表明,TNF-α和腺病毒可以誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞內(nèi)生成ROS和形成8-oxodG的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(%)增加,高表達(dá)hOGG1能夠減少ARPE-19細(xì)胞內(nèi)ROS的生成和修復(fù)TNF-α和腺病毒誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞的氧化損傷。②50ng/mL TNF-a分別干預(yù)hOGGl表達(dá)不同的ARPE-19細(xì)胞24h,用Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測細(xì)胞凋亡比例,結(jié)果發(fā)現(xiàn),和未受干預(yù)的ARPE-19細(xì)胞相比,TNF-α可以引起各干預(yù)組ARPE-19細(xì)胞凋亡比例的增加；進(jìn)一步用熒光定量PCR的方法檢測TNF-α分別干預(yù)hOGG1表達(dá)不同的各組ARPE-19細(xì)胞Fas/FasL凋亡途徑相關(guān)基因FasL、caspase3、caspase8基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),和未受干預(yù)的ARPE-19細(xì)胞相比,各干預(yù)組細(xì)胞上述基因mRNA表達(dá)均上調(diào)。提示TNF-a可以通過Fas/FasL死亡受體途徑引起ARPE-19細(xì)胞的凋亡。以50ng/mL TNF-a干預(yù)hOGGl表達(dá)不同的ARPE-19細(xì)胞24h,與空腺病毒對照組(RPE-Ad-lacZ)和未轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞組相比,高表達(dá)hOGGl組ARPE-19細(xì)胞(RPE-Ad-hogg1)的凋亡比例明顯降低(P0.05)；空腺病毒對照組較未轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞組凋亡比例增高(P0.05)。與兩對照組相比,高表達(dá)hOGG1組ARPE-19細(xì)胞(RPE-Ad-hoggl)的FasL、caspase3、caspase8基因mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)；空腺病毒對照組ARPE-19細(xì)胞(RPE-Ad-lacZ) FasL、caspase3、caspase8基因mRNA的表達(dá)明顯高于未轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞組。說明hOGG1能夠通過Fas/FasL死亡受體通路抑制TNF-α誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞凋亡。綜上所述,本研究表明DNA修復(fù)酶hOGGl在ARPE-19細(xì)胞的高表達(dá)可以降低氧化劑H202、炎癥因子TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和8-oxodG的形成,并能通過Fas/FasL死亡受體通路抑制TNF-α誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞 人8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶 氧化損傷 過氧化氫 腫瘤壞死因子-α 凋亡
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R774.1
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 符號、變量、縮略詞等本論文專用術(shù)語的注釋表11-13
• 緒論13-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述：炎癥因子TNF-α與視網(wǎng)膜疾病的相關(guān)性研究進(jìn)展15-22
• 第二章 hOGG1在H_2O_2和TNF-α誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞產(chǎn)生ROS、氧化損傷和凋亡中的作用22-54
• 前言22-23
• 第一節(jié) hOGG1表達(dá)不同的ARPE-19細(xì)胞模型的建立23-34
• 1. 材料23-26
• 2. 方法26-32
• 3. 結(jié)果32-34
• 第二節(jié) hOGG1在H_2O_2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞產(chǎn)生ROS和氧化損傷的作用34-42
• 1. 材料34-35
• 2. 方法35-37
• 3. 結(jié)果37-42
• 第三節(jié) hOGG1在TNF-α誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞產(chǎn)生ROS、氧化損傷和凋亡中的作用42-54
• 1. 材料42
• 2. 方法42-45
• 3. 結(jié)果45-54
• 討論54-58
• 結(jié)論58-59
• 致謝59-60
• 參考文獻(xiàn)60-68
• 作者簡介68

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：853184