本文關(guān)鍵詞：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡及白內(nèi)障發(fā)病影響的初步研究

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【摘要】：背景白內(nèi)障是引起全球范圍內(nèi)視覺損傷的最主要因素,同時(shí)也是我國導(dǎo)致視力下降的主要原因。隨著我國人口平均壽命的延長及人口老齡化趨勢的加劇,白內(nèi)障的發(fā)生不僅使患者的生活質(zhì)量下降,而且也為醫(yī)療保險(xiǎn)系統(tǒng)及社會(huì)增添了巨大的壓力。而現(xiàn)階段,手術(shù)治療是治愈白內(nèi)障的唯一方式。我們迫切需要從白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制入手來尋找更廣泛的防治手段。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激((Endoplasmic reticulum stress,ERS)已成為近幾年研究的熱點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)在白內(nèi)障的形成中,ERS發(fā)揮著作用。然而仍缺少系統(tǒng)完善的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)論證。本文將從兩個(gè)角度分析在人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡過程中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生發(fā)展對(duì)其的影響。擬更深入的研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機(jī)制問題,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行提供可靠依據(jù)。目的1.研究ERS是否參與年齡相關(guān)性白內(nèi)障和糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生。2.探討在氧化應(yīng)激條件下,ERS的激活對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞(Human lens epithelial cells,HLECs)是細(xì)胞保護(hù)作用還是促凋亡作用。3.探討在ERS發(fā)生的條件下Salubrinal對(duì)HLECs的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法1.采用HE染色和免疫組織化學(xué)的方法檢測年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體前囊膜30例、糖尿病性白內(nèi)障晶狀體前囊膜30例、正常晶狀體30例中GRP78、CHOP、Caspase-12的陽性表達(dá)。2.體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞株HLE-B3于含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基中,以H_2O_2建立氧化應(yīng)激模型誘導(dǎo)ERS的發(fā)生。分別在H_2O_2干預(yù)和不干預(yù)的情況下,加入不同濃度的Salubrinal(10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L、30μmol/L、35μmol/L),應(yīng)用CCK-8試劑盒篩選適宜的Salubrinal濃度。3.實(shí)驗(yàn)分組為A組(正常對(duì)照組)、B組(H_2O_2200μmol/L組)、C組(H_2O_2200μmol/L+Salubrinal25μmol/L組),采用原位缺口末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法和流式細(xì)胞儀檢測藥物作用48h后HLE-B3的凋亡情況。4.不同時(shí)間點(diǎn)下提取B組蛋白,Western blotting檢測不同時(shí)間點(diǎn)下GRP78、CHOP、Caspase-12、p-e IF2α的變化。5.特定時(shí)間點(diǎn)下提取A、B、C組三組蛋白,Western blotting檢測各組GRP78、CHOP、Caspase-12、p-e IF2α的變化。結(jié)果1.HE及免疫組化結(jié)果顯示:所有組織染色充分、固定良好、組織結(jié)構(gòu)完整。3種蛋白在NC組中表現(xiàn)為陰性或弱陽性,而在ARC組與DC組中表達(dá)均為陽性,ARC組陽性率分別為78%、82%、79%,DC組陽性率分別為83%、75%、81%。2.CCK-8試劑盒結(jié)果顯示,沒有H_2O_2干預(yù)時(shí),不同濃度的Salubrinal對(duì)HLE-B3的細(xì)胞活性無明顯抑制作用,存活率分別為98.56±3.29%,98.73±2.58%,99.39±3.23%,98.57±1.89%,98.81±2.46%,99.34±3.23%,99.50±2.36%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.087,P=0.997);應(yīng)用H_2O_2干預(yù)時(shí),隨著Salubrinal濃度的升高,HLE-B3存活分別為52.86±4.67%,65.01±3.56%,72.89±3.82%,84.45±3.57%,91.64±2.14%,93.12±2.92%,92.02±3.33%,與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均為0.000),當(dāng)Salubrinal濃度大于25μmol/L時(shí),HLE-B3細(xì)胞的存活率增加不明顯(#P=0.555、0.878)。3.流式細(xì)胞儀檢測3組的細(xì)胞凋亡率分別為1.93%±0.70%、8.80%±0.51%、4.29%±0.30%,各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=396.263,P=0.000,與A組比較P值均為0.000)。TUNEL染色結(jié)果分別為A組7.67%±0.99%,B組36.90%±0.95%,C組為16.69%±2.16%,凋亡指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=618.393,P=0.000,與A組比較P值均為0.000)。4.Western blotting結(jié)果表明:B組中隨著H_2O_2作用時(shí)間的延長,p-e IF2α在6h表達(dá)量最高,GRP78在12h表達(dá)達(dá)峰,CHOP在12h開始升高,持續(xù)至24h,后又逐漸降低,在48h出現(xiàn)最高表達(dá)量,Caspase-12在48h表達(dá)明顯增加。特定時(shí)間點(diǎn)下C組與B組相比,GRP78、CHOP、p-el F2α表達(dá)量增加,而Caspase-12表達(dá)降低。結(jié)論1.ERS參與年齡相關(guān)性白內(nèi)障及糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生;2.氧化應(yīng)激發(fā)生的早期,ERS激活UPR反應(yīng)從而發(fā)揮著細(xì)胞保護(hù)的作用,隨著氧化應(yīng)激條件的持續(xù),ERS的相關(guān)凋亡通路激活;3.Salubrinal可以通過抑制ERS相關(guān)的凋亡通路,對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)的HLE-B3凋亡起保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：晶體 上皮細(xì)胞 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 細(xì)胞凋亡 桂皮酸鹽類
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R776.1
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 英語縮略詞表12-13
• 前言13-15
• 1 材料與方法15-24
• 2 結(jié)果24-29
• 3 討論29-34
• 4 結(jié)論34-35
• 參考文獻(xiàn)35-40
• 綜述 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與相關(guān)眼科疾病40-58
• 參考文獻(xiàn)51-58
• 個(gè)人簡歷及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果58-59
• 致謝59

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3 陳小t，

本文編號(hào)：850689