發(fā)布時間：2017-09-12 19:35

  本文關鍵詞：STGC3基因高表達對CNE2細胞自噬的影響及機制

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【摘要】：目的:研究STGC3基因高表達,對鼻咽癌CNE2細胞系自噬的影響,并探討其可能的分子機制,為進一步闡明STGC3基因在鼻咽癌發(fā)病中的作用及分子機制提供新的實驗依據(jù)。方法:運用慢病毒表達載體系統(tǒng),建立STGC3基因穩(wěn)定高表達的CNE2細胞系,通過熒光顯微鏡觀察轉染細胞紅色熒光蛋白表達,qRT-PCR技術,檢測STGC3 mRNA水平,實驗確定轉染效率;qRT-PCR及Western Blot方法,檢測自噬相關蛋白LC3-II/LC3-I、p62蛋白水平的變化;GFP-LC3瞬時轉染CNE2細胞,激光共聚焦顯微鏡觀察自噬體的形成;Western Blot方法,檢測p-S6、p-ULK1蛋白水平變化。結果:表達載體經(jīng)DNA測序鑒定,結果表明STGC3高表達慢病毒載體RTP-h STGC3-his成功構建;將空載體(RTP-his)和RTP-h STGC3-his分別轉染至CNE2細胞,熒光顯微鏡下可見RFP表達的紅色熒光,證明RTP-his和RTP-h STGC3-his成功導入CNE2細胞;qRT-PCR方法,檢測結果顯示,RTP-h STGC3-his載體轉染CNE2,CNE2細胞系恢復STGC3基因表達,成功建立STGC3基因穩(wěn)定高表達的CNE2細胞(CNE2-RTP-h STGC3-his);CNE2-RTP-h STGC3-his和CNE2-RTP-his細胞,經(jīng)無糖d-Hanks饑餓處理4h,分為實驗組及陰性對照組,CNE2-RTP-his未經(jīng)饑餓處理作為空白對照組,qRT-PCR和Western Blot檢測結果顯示,陰性對照組CNE2-RTP-his細胞中LC3mRNA表達上調,LC3-II/LC3-I比值升高,p62表達水平降低(P0.01);實驗組CNE2-RTP-h STGC3-his細胞中LC3 mRNA表達下調,LC3-II/LC3-I比值降低,p62表達水平升高(P0.01)。瞬時轉染LC3-GFP融合蛋白并予以饑餓處理,共聚焦顯微鏡可見陰性對照組CNE2-RTP-his細胞中綠色熒光斑點增多,而實驗組CNE2-RTP-h STGC3-his細胞中綠色熒光斑點減少(P0.01),表明實驗組細胞自噬體的形成被抑制;Western Blot檢測結果顯示:饑餓處理,陰性對照組CNE2-RTP-his細胞中p-S6和p-ULK1表達下調,而實驗組CNE2-RTP-h STGC3-his細胞中p-S6和p-ULK1表達上調(P0.01)。結論:1.上調STGC3基因在CNE2細胞的表達,可抑制饑餓誘導的CNE2細胞自噬。2.STGC3基因在CNE2細胞高表達,可通過激活m TOR通路,抑制饑餓誘導的CNE2細胞自噬。
【關鍵詞】：鼻咽癌 STGC3基因 自噬 mTOR CNE2
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.63
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 主要中英文縮略詞表9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 技術路線14-16
• 1、構建 STGC3 高表達 CNE2 細胞系14-15
• 2、STGC3 高表達對 CNE2 細胞系自噬的影響及其分子機制15-16
• 第三章 材料與方法16-36
• 3.1 材料16-21
• 3.2 方法21-36
• 第四章 結果36-50
• 4.1 RTP-h STGC3-his 重組質粒的鑒定36-38
• 4.2 慢病毒載體穩(wěn)定轉染 CNE2 細胞后的 RFP 表達情況38-39
• 4.3 qRT-PCR 檢測轉染過表達載體后 CNE2 細胞中 STGC3 的表達39-42
• 4.4 STGC3 過表達對饑餓處理的 CNE2 細胞 LC3 表達的影響42-44
• 4.5 STGC3 過表達對饑餓處理的 CNE2 細胞 p62 表達的影響44-45
• 4.6 GFP-LC3 融合蛋白檢測 STGC3 高表達對 CNE2 細胞自噬的影響45-47
• 4.7 Westernblot 檢測 STGC3 高表達對 CNE2 細胞 p-S6 及p-ULK1 表達的影響47-50
• 第五章 討論50-56
• 第六章 結論56-58
• 參考文獻58-64
• 綜述64-72
• 參考文獻69-72
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文72-74
• 致謝74

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本文編號：839132