本文關鍵詞：HDAC2表達在突發(fā)性聾患者激素抵抗形成中作用的觀察

  更多相關文章： 突發(fā)性聾 糖皮質激素抵抗 外周血單個核細胞 組蛋白去乙酰化-2 PBMC體外增殖抑制實驗

【摘要】：工作目的：突發(fā)性聾(sudden sensorineural hearing loss, SSNHL)指3天以內發(fā)生的原因不明的感音神經性聽力損失,至少連續(xù)兩個頻率聽力損失大于20dB,同時可伴有耳鳴和眩暈。糖皮質激素(glucocorticoid, GC)是目前治療SSNHL的有效藥物,然而并非所有患者在接受GC治療后都有良好的轉歸,部分患者用GC治療無效,聽力提高不明顯,提示對GC不敏感。本題意圖通過對SSNHL患者的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)進行體外培養(yǎng)并進行PBMC體外增殖GC抑制試驗(in vitro proliferation of GC inhibition test, IVPGCIT),比較不同SSNHL患者PBMC體外增殖抑制情況及其治療后聽力提高的水平,在治療早期便預測患者對GC的敏感性。同時在治療前后檢測SSNHL患者PBMC中組蛋白去乙�；�2(histone deacetylase 2, HDAC2)的水平,比較SSNHL患者HDAC2水平與GC抵抗的關系,以期在將來可對患者盡早進行個性化治療,進一步提高治療的有效率,改善患者的生活質量。研究方法：選擇于我院接受治療的突發(fā)性聾患者,治療前及治療結束后采集患者及的空腹外周血20 ml,同時采取健康志愿者空腹血20ml,作為對照,離心后在超凈臺內分離患者PBMC和自體血漿,然后進行兩部分實驗：1. PBMC體外增殖抑制實驗：將PBMC懸浮于添加了10%患者自體血漿的RPMI1640培養(yǎng)基后分四組進行體外培養(yǎng)增殖抑制實驗：A組為不添加藥物的空白對照,B組加LPS (1 μg/ml),刺激PBMC的增殖,C組同時加入LPS和地塞米松(dexamethasone,DEX) (10-6M), D組為不添加細胞僅有培養(yǎng)基的空白組。將細胞置于37℃,5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時后,觀察細胞生長情況并加入噻唑藍(monotetrazolium, MTT)繼續(xù)共培養(yǎng)4小時,之后,移除上清并加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶解結晶,檢測其在490nm波長處的吸光度(OD值)來反映細胞的增殖抑制情況。將所有患者的PBMC增殖抑制率及發(fā)病至就診天數(shù)與治療后受損頻率平均聽閾(pure tone average, PTA)改善值進行直線相關的比較,并按照受損頻率PTA改善是否≥15dB將患者分為GC有效組以及GC無效組,比較兩組患者PBMC曾殖抑制率、發(fā)病至就診天數(shù)、性別、患耳側別、發(fā)病時的聽力曲線以及是否伴有眩暈對患者聽力預后的影響。2. HDAC2活性及表達檢測：提取PBMC的總RNA和細胞核蛋白,分別用real-time PCR法和HDAC2活性檢測試劑盒,檢測患者PBMC中HDAC2 mRNA的表達水平及HDAC2活性,按照受損頻率PTA改善是否≥15dB將患者分為GC有效組以及GC無效組,比較兩組HDAC2活性以及表達量與聽力預后的關系,探討HDAC2水平與GC抵抗之間的關系。結果：第二章：PBMC體外增殖抑制試驗預測SSNHL患者GC敏感性的臨床觀察：培養(yǎng)24小時后,所有患者的PBMC均可被DEX抑制,但抑制程度有很大差異。將所有患者PBMC增殖抑制率與其各自受損頻率PTA改善程度進行相關性分析,結果顯示二者之間存在正的直線相關關系(R=0.688)。發(fā)病至就診時間與聽力改善呈負相關(R=-0.372),按照治療后PTA改善程度進行分組,GC有效組共28名患者,PBMC平均增殖抑制率為：60.89%±25.29%,平均發(fā)病至就診天數(shù)為：12.75±9.69天,治療前后受損頻率PTA分別為：82.46±13.84dB,53.92±20.92dB。GC無效組22位患者,PBMC平均增殖抑制率為：20.06%±16.42%(與GC有效組相比t=6.89,P=0.000),平均發(fā)病至就診天數(shù)為：24.59±20.92天,治療前后受損頻率PTA分別為：90.27±12.59dB和86.52±13.12dB。多因素分析顯示兩組患者的性別、患耳側別、聽力曲線等均無顯著差異,發(fā)病至就診時間及PBMC增殖抑制率對患者聽力預后有顯著影響。第三章：難治性SSNHL患者PBMC內HDAC2表達與其預后的相關性分析：治療前GC有效組及無效組患者的HDAC2活性顯著低于對照組,而HDAC2 mRNA表達量顯著高于對照組,治療后,兩組患者HDAC2 mRNA表達量較治療前上調,GC有效組患者HDAC2活性上升并接近正常水平,而GC無效組患者HDAC2活性無明顯變化。結論：SSNHL患者PBMC增殖抑制率和發(fā)病至就診時間與聽力改善程度之間密切相關,且PBMC增殖抑制率與聽力預后間的關系更為密切。GC治療有效的患者PBMC被DEX抑制程度顯著高于GC治療無效組,PBMC的IVPGCIT可以預測SSNHL患者對GC的敏感性,并可用來指導突發(fā)性聾的臨床個性化治療。SSNHL患者對GC不敏感可能與體內HDAC2活性降低有關,GC可以促使HDAC2mRNA的表達上調,局部注射GC聯(lián)合全身應用銀杏提取物,可以提高GC敏感患者的HDAC2活性和HDAC2mRNA表達水平,有利于患者聽力提高。
【關鍵詞】：突發(fā)性聾 糖皮質激素抵抗 外周血單個核細胞 組蛋白去乙�；�-2 PBMC體外增殖抑制實驗
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R764.437
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-10
• 縮略詞10-14
• 第一章 緒論14-19
• 參考文獻15-19
• 第二章 PBMC體外增殖抑制試驗預測SSNHL患者聽力預后的臨床關察19-32
• 引言19
• 2.1 實驗材料19-20
• 2.1.1 儀器設備19
• 2.1.2 實驗試劑及耗材19-20
• 2.2 研究對象20
• 2.3 實驗步驟20-22
• 2.3.1 PBMC的分離20-21
• 2.3.2 PBMC體外培養(yǎng)及增殖抑制驗21
• 2.3.3 統(tǒng)計學方21-22
• 2.4 實驗結果22-26
• 2.4.1 臨床資料22
• 2.4.2 各因素與聽力預后的相關性分析22
• 2.4.3 兩組患者的聽力以PBMC增殖抑制率比較22
• 2.4.4 PBMC增殖抑制情況22-23
• 2.4.5 聽力預后與PBMC增殖抑制率及發(fā)病至就診天數(shù)均存在直線相關23-26
• 2.5 討論26-28
• 2.6 結論28
• 參考文獻28-32
• 第三章 難治性SSNHL患者PBMC內HDAC2表達與其預后的相關性分析32-44
• 引言32
• 3.1 實驗方法32-33
• 3.1.1 儀器設備32
• 3.1.2 實驗試劑及耗材32-33
• 3.2 研究對象33
• 3.3 實驗步驟33-36
• 3.3.1 PBMC的分離33
• 3.3.2 提取細胞核蛋白33-34
• 3.3.3 組蛋白濃度測定34
• 3.3.4 HDAC2活性檢測34-35
• 3.3.5 細胞總RNA的提取35
• 3.3.6 Real-time PCR檢測HDAC2 mRNA表達35-36
• 3.3.7 統(tǒng)計學方法36
• 3.4 實驗結果36-39
• 3.4.1 患者一般情況及聽力隨訪結果36-37
• 3.4.2 HDAC2活性及HDAC2 mRNA表達37-39
• 3.5 討論39-41
• 3.6 結論41
• 參考文獻41-44
• 全文總結44-45
• 綜述45-58
• 4.1 突發(fā)性聾的診療現(xiàn)況45-46
• 4.2 部分SSNHL患者存在對GC不敏感46
• 4.3 人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)體外增殖抑制試驗可預估GC的敏感性46-47
• 4.4 GC在治療內耳疾病中的作用機制47-48
• 4.5 HDAC2影響GC敏感性的分子機制48-49
• 4.6 氧化應激可能使HDAC2下調并從而導致GC抵抗49-50
• 4.7 鹽皮質激素受體(mineralocorticoid receptor,MR)對GC作用的影響50-52
• 參考文獻52-58
• 碩士期間發(fā)表文章、獎勵及會議報告58-59
• 致謝59-60

【參考文獻】

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本文編號：808264