本文關(guān)鍵詞：硫醇轉(zhuǎn)移酶在晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激中的表達(dá)和作用研究

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【摘要】：目的:糖尿病持續(xù)高血糖狀態(tài)下,晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)含量相對上升,會誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng),可能參與糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展。硫醇轉(zhuǎn)移酶(Thioltransferase,TTase)作為巰基-二硫化物氧化還原酶家族中的成員,對晶狀體氧化還原平衡狀態(tài)的維持具有非常重要的作用。本實驗觀察AGEs對人晶狀體上皮細(xì)胞氧化還原狀態(tài)和TTase表達(dá)的影響,初步研究在AGEs誘導(dǎo)引發(fā)的氧化損傷中,TTase可能參與的作用機(jī)制,為進(jìn)一步探究糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制提供新思路。方法:1.體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞,實驗組采用AGEs-BSA濃度為1.5 mg/ml,10%(v/v)胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng);陰性對照組加入相同濃度的牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),分別于1 d,2 d,3 d,4 d收集細(xì)胞,測定細(xì)胞內(nèi)ROS含量,SOD,CAT活性,并且測定TTase活性,q RT-PCR技術(shù)檢測TTase m RNA表達(dá),Western blot檢測TTase蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。2.將前期篩選出來的轉(zhuǎn)染效率較為理想的TTase si RNA轉(zhuǎn)染至人晶狀體上皮細(xì)胞,測定干擾效率。設(shè)立正常對照組,AGEs-BSA組,AGEs-BSA+TTase si RNA陰性對照組和AGEs-BSA+TTase si RNA干擾組,培養(yǎng)2d后測定細(xì)胞內(nèi)ROS含量,SOD活性、CAT活性和GSSG/T-GSH。結(jié)果:1.AGEs-BSA處理后細(xì)胞內(nèi)ROS含量隨著作用時間延長逐漸增高,測得1 d,2d,3 d,4 d ROS含量分別為:153.67±24.57,180±11.55,268.01±20.50和313.33±35.46相對熒光單位,較正常對照組明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。測得細(xì)胞內(nèi)CAT活性于1 d,2 d,3 d,4 d時分別為10.07±0.84,9.27±0.72,7.05±0.88和5.30±1.67U/mg protein,其中2 d,3 d,4 d較正常對照組有明顯下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),SOD活性于1 d,2 d,3 d,4 d分別為104.21±3.95,92.98±8.98,86.54±3.57和81.56±5.06 U/mg protein,較正常對照組有顯著性下降(P0.05),CAT與SOD的活性均隨著時間作用延長逐漸下降,BSA對照組與正常對照組無顯著差異。2.AGEs-BSA處理后晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)TTase m RNA表達(dá)水平增高,于2 d時達(dá)到峰值,約為正常對照組的5.06倍(P0.01)。隨后表達(dá)開始下降,3d時為正常對照組的3.53倍(P0.01)。4 d時繼續(xù)下降,為正常對照組的3.10倍。TTase活性1d,2 d,3 d,4 d分別為8.03±0.86,10.82±0.51,11.05±0.83,8.63±0.77 m U/mg protein,呈先上升后下降的趨勢。培養(yǎng)至2 d時,為正常對照組的1.53倍,于3 d時,為正常對照組的1.69倍,均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。BSA處理組TTase活性于1~4 d未見明顯變化趨勢。AGEs-BSA處理組3 d時TTase蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.ROS含量測定結(jié)果在正常對照組、AGEs-BSA組、AGEs-BSA+TTase si RNA陰性對照組以及AGEs-BSA+TTase si RNA干擾組中,分別為93.33±21.85,190.30±9.84,188.02±19.31和280.32±18.35相對熒光單位,AGEs-BSA+TTase si RNA干擾組細(xì)胞內(nèi)ROS含量與AGEs-BSA+TTase si RNA陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。GSSG/T-GSH結(jié)果在正常對照組、AGEs-BSA組、AGEs-BSA+TTase si RNA陰性對照組以及AGEs-BSA+TTase si RNA干擾組分別為:(3.20±0.47)%,(11.35±0.62)%,(10.86±1.50)%和(16.45±0.64)%,AGEs-BSA+TTase si RNA干擾組細(xì)胞內(nèi)GSSG/T-GSH最高,與AGEs-BSA+TTase si RNA陰性對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。正常對照組、AGEs-BSA組、AGEs-BSA+TTase si RNA陰性對照組以及AGEs-BSA+TTase si RNA干擾組的SOD活性測定結(jié)果分別為119.77±8.42,92.98±8.98,79.78±6.05和54.15±9.06 U/mg protein。CAT活性測定結(jié)果分別為15.07±0.78,9.27±0.73,9.01±1.52和4.01±0.94 U/mg protein,AGEs-BSA+TTase si RNA干擾組細(xì)胞SOD和CAT活性與AGEs-BSA+TTase si RNA陰性對照組比較顯著降低(P0.05)。結(jié)論:AGEs影響人晶狀體上皮細(xì)胞的氧化還原狀態(tài),增加ROS水平,使抗氧化酶SOD和CAT部分失活。然而在AGEs作用初期,TTase表達(dá)與活性增強(qiáng),參與細(xì)胞早期的抗氧化損傷作用,其機(jī)制可能為修復(fù)SOD和CAT活性,降低GSSG/T-GSH,ROS含量,從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的平衡。
【關(guān)鍵詞】：晚期糖基化終產(chǎn)物 硫醇轉(zhuǎn)移酶 晶狀體上皮細(xì)胞 糖尿病性白內(nèi)障
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2;R776.1
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-15
• 文獻(xiàn)回顧15-28
• 引言28-29
• 1 材料29-32
• 1.1 細(xì)胞29
• 1.2 主要儀器29-30
• 1.3 主要試劑30
• 1.4 主要溶液配制30-32
• 2 方法32-44
• 2.1 人晶狀體上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)32-33
• 2.2 人晶狀體上皮細(xì)胞的分組和處理33-34
• 2.3 TTase表達(dá)和活性的測定34-39
• 2.4 TTase siRNA的轉(zhuǎn)染和干擾效率的評價39
• 2.5 相關(guān)生化指標(biāo)的測定39-44
• 2.6 統(tǒng)計學(xué)分析方法44
• 3 結(jié)果44-53
• 3.1 AGEs-BSA對人晶狀體上皮細(xì)胞氧化狀態(tài)的影響44-46
• 3.2 AGEs-BSA作用不同時間對人晶狀體上皮細(xì)胞TTase的影響46-48
• 3.3 TTase在AGEs-BSA誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用48-53
• 4 討論53-57
• 小結(jié)57-58
• 參考文獻(xiàn)58-67
• 個人簡歷和研究成果67-68
• 致謝68

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