本文關(guān)鍵詞：鼻咽癌患者外周血漿及循環(huán)腫瘤細(xì)胞中hTERT mRNA的定量檢測(cè)及其臨床意義

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【摘要】：研究背景：鼻咽癌是我國(guó)南方高發(fā)的一種惡性腫瘤,特別是在廣東地區(qū)。目前鼻咽癌確切的發(fā)病原因尚未研究清楚,大量的研究結(jié)果顯示遺傳因素、EB病毒感染、環(huán)境因素及飲食因素等與其密切相關(guān)。鼻咽癌多發(fā)于男性,高發(fā)于40-50歲患者。隨著影像水平的迅猛發(fā)展和放射治療水平的不斷提高,鼻咽癌早期患者5年生存率高達(dá)70%以上。但是大部分鼻咽癌早期發(fā)病無明顯的特異性,也缺乏有效的早期診斷指標(biāo),大部分就診時(shí)已發(fā)展至晚期,大多伴有頸部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。這無疑大大降低了鼻咽癌的臨床治愈率,生存率及生存質(zhì)量也急劇降低。EB病毒已研究證實(shí)與鼻咽癌的發(fā)生息息相關(guān),各種針對(duì)EB病毒的特異性抗原和抗體的檢測(cè)是目前臨床早期診斷和篩查鼻咽癌的主要手段,常用的VCA-IgA及EA-IgA檢測(cè),但靈敏度和特異性都不高,這不僅可能使早期腫瘤漏網(wǎng),也給非腫瘤患者增加精神負(fù)擔(dān)。關(guān)于鼻咽癌的早期診斷指標(biāo)的探尋和確定,是相關(guān)研究者的重要任務(wù)。隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展,腫瘤相關(guān)分子標(biāo)記物的檢測(cè)給腫瘤的早期診斷、療效評(píng)估及預(yù)后隨訪開啟了新的篇章。腫瘤患者外周循環(huán)游離核酸分子的檢測(cè)是醫(yī)學(xué)工作者關(guān)注的熱點(diǎn)。在正常人和腫瘤患者的外周血液中均存在各種各樣的游離核酸,與腫瘤相關(guān)的的特異性核酸的檢測(cè)對(duì)于腫瘤患者的診斷和治療有著重要的價(jià)值。端粒是近年來生命科學(xué)研究的熱點(diǎn),端粒酶的激活與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。端粒酶是-種自身攜帶模板的逆轉(zhuǎn)錄酶,它在細(xì)胞中負(fù)責(zé)延長(zhǎng)端粒,而端粒長(zhǎng)度是決定細(xì)胞增殖能力和壽命的分子標(biāo)志。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)是端粒酶的亞單位,能以端粒自身所攜帶的RNA為模板合成端粒DNA,并加到染色體末端以延長(zhǎng)端粒維持染色體的穩(wěn)定進(jìn)而延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命甚至可促使細(xì)胞永生化。hTERT只能在具有端粒酶活性的細(xì)胞中檢測(cè)到,包括胚胎干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、活化的淋巴細(xì)胞及絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞,其表達(dá)水平與端粒酶的活性呈正相關(guān)。已有大量研究證實(shí),端粒酶及其亞單位在鼻咽癌及絕大多數(shù)惡性腫瘤中高表達(dá),而在正常人體細(xì)胞中為陰性表達(dá)。近期人們?cè)谘獫{端粒酶hTERT mRNA方面做了許多的工作,血漿hTERT mRNA有望成為腫瘤早期診斷、療效評(píng)估和預(yù)后判斷的一個(gè)新的分子生物學(xué)指標(biāo)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞近年來日益成為研究的熱點(diǎn)。關(guān)于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的大量報(bào)道已證實(shí),循環(huán)腫瘤細(xì)胞和腫瘤的診斷及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān),同時(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)療程中腫瘤循環(huán)腫瘤細(xì)胞的變化,有助于及時(shí)評(píng)價(jià)治療效果,隨時(shí)調(diào)整治療方案。因此,深入了解循環(huán)腫瘤細(xì)胞對(duì)于腫瘤的診斷、治療及預(yù)后均具有重要的意義。國(guó)內(nèi)外已有大量研究報(bào)道以腫瘤特異性分子標(biāo)記物為載體,用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)研究腫瘤患者外周血微量腫瘤細(xì)胞,已經(jīng)應(yīng)用于肺癌、乳腺癌、前列腺癌等微轉(zhuǎn)移的研究。綜上：外周循環(huán)腫瘤細(xì)胞及血漿中腫瘤特異性RNA在腫瘤研究中均具有重要的價(jià)值。聯(lián)合檢測(cè)外周血腫瘤細(xì)胞及游離RNA用于腫瘤的診斷及治療目前也尚未有報(bào)道。我們將用前瞻性的研究方法,通過實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)檢測(cè)鼻咽癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞及外周游離血漿中hTERT mRNA的表達(dá)水平,來了解其在鼻咽癌診斷及治療中的臨床應(yīng)用價(jià)值。目的：利用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)技術(shù)定量檢測(cè)鼻咽癌患者外周血漿及循環(huán)腫瘤細(xì)胞中人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞單位(hTERT) mRNA的表達(dá),研究其其表達(dá)與患者的性別、年齡及腫瘤瘤的臨床分期、大小及淋巴結(jié)浸潤(rùn)范圍等臨床病理因素的關(guān)系,并探討其在鼻咽癌中的診斷及治療中意義,并將兩者進(jìn)行相關(guān)性分析,進(jìn)一步探討血漿中hTERT mRNA的來源。方法：1血漿中hTERT mRNA:33例鼻咽癌患者均來自南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院耳鼻喉科,治療前所有患者按常規(guī)進(jìn)行胸部正側(cè)位片、腹部B超、頭頸部增強(qiáng)CT、 MRI、全身骨掃描(SPECT)確定腫瘤的侵犯的范圍和臨床分期。入組標(biāo)準(zhǔn)：既往未接受過放射治療者；無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；療程中斷不超過5天；患者簽署化療及放療同意書；病理為鼻咽低分化鱗癌；不伴有第二原發(fā)癌；年齡75歲；卡氏評(píng)分70。排除標(biāo)準(zhǔn)：放療后復(fù)發(fā)再治療；未完成治療者；合并其他內(nèi)科嚴(yán)重疾患(腦中風(fēng)、糖尿病、高血壓、心臟病等)；病理為非低分化鱗癌存在系統(tǒng)性疾病；發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；妊娠或哺乳期婦女；嚴(yán)重骨髓功能障礙者,任何其他狀況為放化療禁忌癥者。按鼻咽癌2008臨床分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行系統(tǒng)分期,其中4例Ⅰ期,5例Ⅱ期,17例Ⅲ期,7例Ⅳ期；11例T1,6例T2,13例T3,3例T4,4例NO；5例N1,17例N2,7例N3；所有病例均為M0,病理學(xué)檢測(cè)全部為未分化型鱗狀細(xì)胞癌。33例患者年齡跨度為23-70歲,中位年齡為49歲,其中男16例,女17例。放療方案：所有患者均于誘導(dǎo)化療結(jié)束后5-15天內(nèi)接受放射治療。放射源使用直線加速器6MVX線。調(diào)強(qiáng)放療組腫瘤區(qū)(GTV)處方量為68-72Gy,每次分割量為2.2-2.4Gy,每周照射5次�；煼桨福核谢颊哒T導(dǎo)化療方案為鉑類(順鉑/泉鉑)+5-FU,劑量為:DDP60-100mg/m2d1+5-FU 500-1000mg/m2d2-5,部分患者在此基礎(chǔ)上加上艾素/環(huán)磷酰胺,艾素的劑量為60-75mg/m2d1。同步化療使用順鉑3周一次的化療方案(順鉑50-80mg/m2)或順鉑每周一次的化療方案(20-40mg/m2)。其中Ⅰ、Ⅱ期患者直接行放療,Ⅲ、Ⅳ期行兩個(gè)療程誘導(dǎo)化療后再行放療。治療前、誘導(dǎo)化療后及放療后分別于上午6時(shí)到9時(shí)之間采集外周血2mL, EDTA抗凝,2h內(nèi)2000rpm,離心10 min,分離血漿并保存于-80℃冰箱備用。24名健康對(duì)照來自珠江醫(yī)院耳鼻喉科住院患者,為慢性鼻竇炎、慢性中耳炎、聲帶息肉等常見病患者,本組征得南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并且經(jīng)患者簽署知情同意書。標(biāo)本處理同前。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(QPCR)檢測(cè)33例鼻咽癌患者治療(放療或化療)前后血漿中hTERT mRNA的表達(dá),并分析其與臨床病理因素的關(guān)聯(lián),以24例健康志愿者作為對(duì)照。2.外周循環(huán)腫瘤細(xì)胞中hTERT mRNA:入組患者為2013年9月至2014年6月南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院耳鼻喉科收治的鼻咽癌患者33例,同第一章中的納入及排除標(biāo)準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)對(duì)象的33例患者同第一章。實(shí)驗(yàn)組患者取兩管血液,第一管如第一章中的處理方法,收集血漿備用,第二管如下敘述,收集外周血單個(gè)核細(xì)胞,備用。患者均經(jīng)病理學(xué)確診為低分化型鱗狀細(xì)胞癌且既往未經(jīng)任何治療。按鼻咽癌2008臨床分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行系統(tǒng)分期,其中4例Ⅰ期,5例Ⅱ期,17例Ⅲ期,7例Ⅳ期；11例T1,6例T2,13例T3,3例T4,4例NO；5例N1,17例N2,7例N3；所有病例均為M0,病理學(xué)檢測(cè)全部為未分化型鱗狀細(xì)胞癌。33例患者年齡跨度為23-70歲,中位年齡為49歲,其中男16例,女17例。同時(shí),收集健康志愿者外周血標(biāo)本20例,健康對(duì)照來自珠江醫(yī)院耳鼻喉科住院患者,為慢性鼻竇炎、慢性中耳炎、聲帶息肉等常見病患者,本組征得南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并且經(jīng)患者簽署知情同意書。本研究通過了南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理協(xié)會(huì)審核,病理標(biāo)本的采集和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均經(jīng)患者知情同意。鼻咽患者治療前后分別于上午6時(shí)到9時(shí)之間于外周靜脈采血,采血時(shí)第1管血棄之不用,取第2管血2mL置入真空無菌肝素抗凝的試管。2小時(shí)內(nèi)加入淋巴細(xì)胞分離液2500r/min離心20min后收集界面細(xì)胞,得到單個(gè)核細(xì)胞層(腫瘤細(xì)胞在此層),最后用PBS緩沖液洗滌一次,-80℃保存。20名健康對(duì)照來自珠江醫(yī)院耳鼻喉科住院患者,標(biāo)本處理同前。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(QPCR)檢測(cè)33例鼻咽癌患者治療(放療或化療)前后循環(huán)腫瘤細(xì)胞中hTERT mRNA的表達(dá),并分析其與臨床病理因素的關(guān)聯(lián),以20例健康志愿者作為對(duì)照。結(jié)果：1.血漿中hTERT mRNA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,健康志愿者血漿中hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.95±0.37,鼻咽癌患者血漿中hTERT mRNA含量達(dá)到10.75±4.29(P0.05)。鼻咽癌患者血漿中hTERT mRNA的表達(dá)與年齡、性別無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而與臨床分期、T分期及N分期浸潤(rùn)范圍有顯著性差異(P0.05)。早期患者(Ⅰ、Ⅱ期),放療后其表達(dá)量(3.43±1.42)較治療前(5.60±2.33)明顯下降；晚期患者(Ⅲ、Ⅳ期)誘導(dǎo)化療及放療后其表達(dá)量較治療前(12.68±3.08)分別降為10.68±2.48、3.13±1.69(P0.05)。2.鼻咽癌外周循環(huán)腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示健康志愿者中hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量為分別為1.09±0.40,鼻咽癌患者外周血中hTERT mRNA含量分別達(dá)到10.65±4.28(P0.05)。鼻咽癌患者外周血hTERT mRNA的表達(dá)與臨床分期、腫瘤侵犯范圍、淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有顯著性差異(P0.05)。治療后hTERT mRNA的表達(dá)量由10.65±4.28降低至5.59±2.32。3.血漿hTERT mRNA相對(duì)含量與外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞中hTERT mRNA相對(duì)含量之間具有相關(guān)性,兩者之間的相關(guān)系數(shù)為0.981,高度相關(guān)。結(jié)論：鼻咽癌患者血漿和外周循環(huán)細(xì)胞中hTERT mRNA的表達(dá)明顯升高,放化療能夠有效抑制該基因的表達(dá),而且該基因的含量與腫瘤的臨床分期、大小及淋巴結(jié)浸潤(rùn)范圍等臨床病理因素密切相關(guān)。鼻咽癌患者血漿和外周循環(huán)細(xì)胞中hTERT mRNA的表達(dá)明顯升高從而提示檢測(cè)鼻咽癌患者外周血中hTERT mRNA的含量,有可能為鼻咽癌患者早期診斷及治療預(yù)后提供重要信息。鼻咽癌患者血漿和外周循環(huán)細(xì)胞中hTERT mRNA的表達(dá)也高度相關(guān),可以部分解釋血漿中hTERT mRNA的來源。
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌 hTERT mRNA 循環(huán)腫瘤細(xì)胞 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.63
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-22
• 第一章 鼻咽癌患者外周血漿中端粒酶hTERT mRNA的定量檢測(cè)及其臨床意義22-37
• 1. 背景22-23
• 2. 材料與方法23-26
• 3. 結(jié)果26-33
• 4. 討論33-37
• 第二章 鼻咽癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞中hTERTmRNA的定量檢測(cè)及臨床意義37-49
• 1. 背景37-38
• 2. 材料與方法38-41
• 3. 結(jié)果41-46
• 4. 討論46-49
• 第三章 鼻咽癌外周血漿及循環(huán)腫瘤細(xì)胞中hTERTmRNA的相關(guān)性及討論49-52
• 1. 背景49
• 2. 材料及方法49-50
• 3 統(tǒng)計(jì)方法50
• 4 結(jié)果50-51
• 5. 討論51-52
• 全文小結(jié)52-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 綜述57-70
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 中英文縮略詞表70-71
• 碩士期間研究成果71-72
• 致謝72-73

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 鄭s，

本文編號(hào)：727737