發(fā)布時間：2017-08-22 23:23

  本文關(guān)鍵詞：miR-15b-5p在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中的表達及意義

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【摘要】：目的:糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy,DR)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)常見的并發(fā)癥之一,現(xiàn)已成為成人最主要的致盲因素,嚴重影響了患者的生活質(zhì)量。目前,隨著糖尿病發(fā)病率的逐年上升,DR的患病人數(shù)也在逐年增多。DR的發(fā)生機制復雜,目前尚不十分明確。關(guān)于DR的發(fā)病機制存在多種學說,如蛋白激酶C-甘油二酯、多元醇通路激活、晚期糖基化終末產(chǎn)物增多、氧化應激等均與DR的發(fā)病密切相關(guān)。已有研究證實,micro RNAs在DR的發(fā)生機制中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。micro RNAs是一類內(nèi)源性非編碼小RNA,主要通過抑制信使RNA(m RNA)的轉(zhuǎn)錄后翻譯來調(diào)控蛋白表達。由于micro RNAs在DR發(fā)病過程中的機制尚不明確,本實驗通過分析糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中的micro RNAs進行表達譜分析,挑選出顯著差異性表達micro RNAs進行生物信息學分析,篩選可能與DR發(fā)生有關(guān)的micro RNAs,用在線軟件預測系統(tǒng)預測其靶分子,最終在基因水平上進一步揭示在DR發(fā)生的機制,為DR的預防和治療提供全新的依據(jù)和思路。方法:1制備糖尿病大鼠模型:選取體重介于200-220g之間的雄性SD大鼠30只,將其隨機分為兩組,其中對照組10只,糖尿病組20只。腹腔單次注射檸檬酸緩沖液60 mg/kg作為對照組,腹腔單次注射1%STZ60mg/kg,作為實驗組。72小時之后,檢測SD大鼠尾部末端靜脈血漿葡萄糖水平,若血糖值大于16.7mmol/L提示造模成功。2制備糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變模型:造模成功后,在糖尿病SD大鼠8周、12周、16周時摘取眼球。其中一只眼球摘取后迅速剝離視網(wǎng)膜組織凍于液氮中保存用于micro RNAs的檢測,另一只眼球摘取后置于4%的多聚甲醛中固定,固定48小時后的眼球組織一部分制備成蠟塊進行HE染色測量視網(wǎng)膜厚度并對神經(jīng)節(jié)細胞(Ganglion cell,GCL)的數(shù)量進行統(tǒng)計學分析,固定好的另一部分的眼球組織在解剖顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜組織,放于37℃3%的胰蛋白酶中消化2小時,待其消化至一層透明的血管網(wǎng)時,將其撈至潔凈的防脫載玻片上并進行過碘酸-雪夫反應(糖原染色、PAS)染色,觀察視網(wǎng)膜血管的大致形態(tài)及典型改變進行分析。3根據(jù)前期用HUVECs制備的氧化應激模型的micro RNAs基因表達譜改變情況,結(jié)合分析人與大鼠種屬差異性的情況,篩選可能與我們的研究相關(guān)的micro RNAs。4用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)方法檢測micro RNAs在SD大鼠視網(wǎng)膜組織中的表達,并通過全基因組及代謝途徑數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes,KEGG)分析異常表達micro RNAs可能參與的信號通路。應用DAVID軟件對異常表達的micro RNAs進行靶基因預測并對可能參與的信號通路進行生物功能富集分析(Enrichment for Gene Ontology,GO)。5統(tǒng)計學方法:所有數(shù)據(jù)采用(x±s)表示。用IBM SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)處理,結(jié)果采用方差分析和獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計學分析,以P0.05為有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:1對照組10只SD大鼠的靜脈血糖水平均在正常范圍;實驗組20只SD大鼠中一只死亡,剩余19只均造模成功,即靜脈血糖水平大于16.7mmol/L。2摘取對照組及實驗組大鼠眼球后進行HE染色,測量視網(wǎng)膜層特定部位厚度后統(tǒng)計得出,實驗組大鼠的視網(wǎng)膜厚度與正常對照組大鼠相比下降,GCL數(shù)量減少。PAS染色提示16周時實驗組視網(wǎng)膜血管出現(xiàn)典型改變。其中造模成功后16周的實驗組大鼠變化最明顯,故在接下來的實驗中提取造模成功后16周的實驗組大鼠的視網(wǎng)膜組織進行micro RNAs檢測。3 micro RNAs芯片結(jié)果:與正常對照組相比,實驗組有5個顯著差異表達的micro RNAs(P0.05),綜合分析micro RNAs芯片結(jié)果,應用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)的方法檢測實驗組大鼠視網(wǎng)膜組織中miR-15b-5p,miR-17-5p,miR-195-5p,miR-497-5p,miR-106b-5p的表達,其中miR-15b-5p在大鼠視網(wǎng)膜組織中的相對表達量變化最為明顯。4 miR-15b-5p的生物信息學分析結(jié)果顯示:miR-15b-5p參與了鈣離子信號通路、內(nèi)吞作用、胰島素信號通路、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、2型糖尿病、粘附作用、前列腺癌等多個生物學過程。miR-15b-5p的靶基因主要參與了2型糖尿病、胰島素信號通路及細胞凋亡等多種生物學過程的調(diào)控。結(jié)論:1糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜組織中存在多種micro RNAs的改變,其中miR-15b-5p變化最為明顯。2 miR-15b-5p表達的上調(diào)可能參與了DR的分子生物學過程。3生物信息學分析結(jié)果揭示miR-15b-5p參與多種信號通路,可能參與了DR的發(fā)生和發(fā)展并作為機制之一。
【關(guān)鍵詞】：糖尿病視網(wǎng)膜病變 鏈脲佐菌素 糖尿病 MicroRNAs 生物信息學分析
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R774.1
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文縮寫10-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-19
• 結(jié)果19-20
• 附圖20-23
• 附表23-28
• 討論28-33
• 結(jié)論33-34
• 參考文獻34-36
• 綜述 microRNAs與糖尿病血管并發(fā)癥之間的關(guān)系36-50
• 參考文獻42-50
• 致謝50-51
• 個人簡歷51

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 李玉媚;王輝;張文宇;陳偉;胡楠;歐和生;;內(nèi)含子源性miRNA通過轉(zhuǎn)錄因子AP1調(diào)節(jié)內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達及血管內(nèi)皮細胞增殖作用[J];中國動脈硬化雜志;2014年07期

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本文編號：721658