本文關鍵詞：Notch基因轉染體外培養(yǎng)的兔角膜內(nèi)皮細胞調(diào)控其增殖分化的研究

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【摘要】：本文旨在選出Notch家族成員中表達最強的基因,將該基因通過慢病毒載體介導轉入體外培養(yǎng)的兔角膜內(nèi)皮細胞中,研究轉基因的兔角膜內(nèi)皮細胞增殖及分化的轉變,探討運用轉基因技術治療角膜內(nèi)皮細胞病的可能。通過撕取后彈力層法培養(yǎng)兔角膜內(nèi)皮細胞;逆轉錄PCR擴增目的基因片段選出Notch家族各成員中表達最強的基因,構建重組慢病毒載體轉染體外培養(yǎng)的的兔角膜內(nèi)皮細胞,運用MTT法、免疫熒光、RT-PCR、倒置顯微鏡等方法觀察記錄兔角膜內(nèi)皮細胞的增殖及分化情況.撕取后彈力層體法可獲得較純凈的單層兔角膜內(nèi)皮細胞。Notch家族中的受體Notch2、Notch3及配體Delta1、Jagged1在兔角膜內(nèi)皮細胞中有表達,且Notch3表達最強。慢病毒載體在MOI=100時,轉染體外培養(yǎng)的兔角膜內(nèi)皮細胞72h后其轉染效率高達60%以上。Notch3基因的轉染使與內(nèi)皮細胞分化相關的a-SMA、增殖相關的Ki-67基因的表達增強,細胞連接標志基因ZO-1、N-cadherin的表達降低。慢病毒介導的Notch3基因可成功轉入體外培養(yǎng)的兔角膜內(nèi)皮細胞中并穩(wěn)定表達,Notch3基因的過表達提高了Notch信號通路對兔角膜內(nèi)皮細胞的增殖和分化的調(diào)控能力,該過程可被γ-分泌酶抑制劑DAPT阻斷。為轉基因技術治療角膜內(nèi)皮細胞病提供了新思路。
【關鍵詞】：角膜內(nèi)皮細胞 轉染 Notch 分化 增殖
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R772.2
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• 英文摘要5-8
• 第一章 緒論8-10
• 第二章 材料與方法10-16
• 1．實驗材料10-12
• 2.實驗方法12-15
• 3.統(tǒng)計學分析15-16
• 第三章 實驗結果16-22
• 1.Notch 家族成員在兔角膜內(nèi)皮細胞中的表達情況16
• 2.慢病毒轉染效率16-17
• 3. 細胞形態(tài)學觀察17-18
• 4．MTT 法檢測兔角膜內(nèi)皮細胞轉基因前后增殖能力18-19
• 5. 相關基因及蛋白表達水平的變化19-22
• 第四章 討論22-26
• 第五章 結論26-28
• 參考文獻28-32
• 綜述32-42
• 參考文獻37-42
• 發(fā)表論文42-44
• 致謝44

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本文編號：714875