本文關(guān)鍵詞：Vimentin野生型和E151K突變體穩(wěn)定表達(dá)晶狀體細(xì)胞株的建立

  更多相關(guān)文章： Vimentin E151K SUMO SUMO化 白內(nèi)障 α-TN4-1

【摘要】：波形蛋白Vimentin是一種在內(nèi)皮或者其他間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的III型中間纖維蛋白,眼睛晶狀體上皮細(xì)胞中就有大量表達(dá)的波形蛋白。波形蛋白有三個(gè)結(jié)構(gòu)域,由一個(gè)含α螺旋的中心桿域連接N端的頭部域和C端的尾部域。作為一種主要的骨架蛋白,波形蛋白參與細(xì)胞核與膜的連接和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),影響晶狀體細(xì)胞的分化,與細(xì)胞的遷移和運(yùn)動(dòng)有關(guān),在偽足中就有波形蛋白。波形蛋白還受磷酸化作用的調(diào)節(jié),蛋白激酶C可調(diào)控它的一些磷酸化位點(diǎn)。此外,波形蛋白在癌細(xì)胞中高表達(dá)使癌細(xì)胞獲得侵襲性。晶狀體正常狀態(tài)的維持與波形蛋白息息相關(guān),波形蛋白基因突變會(huì)導(dǎo)致波形蛋白組裝紊亂從而引發(fā)疾病。波形蛋白編碼基因外顯子1第596號(hào)堿基的突變(G596A)造成第151號(hào)位的谷氨酸突變成賴(lài)氨酸(E151K),導(dǎo)致Vimentin骨架蛋白組裝紊亂。由于跟SUMO特異性結(jié)合的底物一般都具有一個(gè)相同的基序ΨKx E/D,其中Ψ為疏水性氨基酸,K為目標(biāo)賴(lài)氨酸,x是任何氨基酸,所以E151K的突變將導(dǎo)致一個(gè)十分保守的SUMO化位點(diǎn)的產(chǎn)生。我們推測(cè)E151K突變可能導(dǎo)致Vimentin單體被SUMO化,造成晶狀體中波形蛋白纖維組裝困難,從而產(chǎn)生白內(nèi)障。為了證明此推測(cè),我們構(gòu)建了Vimentin野生型和E151K cDNA突變體的質(zhì)粒,并把野生型和突變體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入了小鼠的晶狀體上皮細(xì)胞α-TN4-1中,用含有600ug/ml的G418培養(yǎng)基篩選,建立了穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株,并用免疫熒光染色技術(shù)觀察到了轉(zhuǎn)染細(xì)胞與正常細(xì)胞的形態(tài)差異。為進(jìn)一步確定E151K是否能被SUMO化而導(dǎo)致Vimentin組裝病變打下了必要的基礎(chǔ)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn):正常的α-TN4-1細(xì)胞的波形蛋白骨架十分清晰,在遠(yuǎn)核端匯聚形成的放射線筆直而修長(zhǎng);轉(zhuǎn)染了VIM的細(xì)胞雖也觀察到由波形蛋白形成的細(xì)長(zhǎng)的延伸部分,但明顯在延伸的多處都發(fā)生了彎曲;而轉(zhuǎn)染了E151K的細(xì)胞則觀察不到延伸部分或延伸部分明顯縮減,波形蛋白圍繞在核周?chē)什灰?guī)則彌散狀。
【關(guān)鍵詞】：Vimentin E151K SUMO SUMO化 白內(nèi)障 α-TN4-1
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R776;Q51
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 第一章 前言12-24
• 1 中間纖維家族12-14
• 1.1 中間纖維的結(jié)構(gòu)12-13
• 1.2 中間纖維和細(xì)胞骨架13
• 1.3 中間纖維和眼睛晶狀體13-14
• 2 波形蛋白（Vimentin）14-19
• 2.1 波形蛋白的結(jié)構(gòu)15
• 2.2 波形蛋白組裝和去組裝15
• 2.3 波形蛋白和細(xì)胞接觸15-16
• 2.4 波形蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)16
• 2.5 波形蛋白和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)16-17
• 2.6 波形蛋白和癌細(xì)胞17-18
• 2.7 胚胎發(fā)生中波形蛋白的表達(dá)18
• 2.8 波形蛋白突變E151K和白內(nèi)障18-19
• 3 小泛素相關(guān)修飾物（SUMO）19-23
• 3.1 SUMO家族20-21
• 3.2 SUMO與泛素化21
• 3.3 SUMO化修飾的酶學(xué)21-22
• 3.4 SUMO化的功能22-23
• 4 本課題研究背景23-24
• 第二章 材料、試劑以及研究方法24-42
• 1 本實(shí)驗(yàn)的材料24
• 2 本實(shí)驗(yàn)的試劑24
• 3 實(shí)驗(yàn)儀器24-25
• 4 實(shí)驗(yàn)方法25-42
• 4.1 獲得小鼠晶狀體c DNA25-26
• 4.2 克隆小鼠晶狀體Vimentin26-32
• 4.3 克隆小鼠VIM突變體E151K32-35
• 4.4 保存VIM和E151K的質(zhì)粒及菌液35-36
• 4.5 建立Vimentin和E151K穩(wěn)定的晶狀體細(xì)胞株36-38
• 4.6 PCR檢測(cè)Vimentin和E151K穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的晶狀體細(xì)胞株38-40
• 4.7 細(xì)胞免疫熒光染色40-42
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論42-59
• 1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-57
• 1.1 小鼠VIM PCR結(jié)果及序列比對(duì)42-44
• 1.2 小鼠突變體E151K PCR結(jié)果及序列比對(duì)44-46
• 1.3 檢測(cè)PCR結(jié)果46
• 1.4 免疫熒光染色結(jié)果圖46-57
• 2 實(shí)驗(yàn)討論57-59
• 參考文獻(xiàn)59-68
• 附錄68-69
• 致謝69

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 呂海俠,劉勇,李敏杰,肖新莉,丁海燕,凌鳳東;人腦不同發(fā)育期vimentin陽(yáng)性細(xì)胞的分布[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2002年14期

2 趙士福;黃其林;李黔寧;Jean Gascuel;;中間絲蛋白vimentin在非洲爪蛙嗅球發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)及意義[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;2007年01期

3 趙新燕,馮麗冰,周偉國(guó),戴衛(wèi)列,李昌本,趙壽元;Screening of proteins that interact with human thrombopoietin receptor c-Mpl using yeast two-hybrid system[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2000年03期

4 ;Shock Waves Increase T-cell Proliferation or IL-2 Expression by Activating p38 MAP Kinase[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2004年11期

5 劉光,丁華野,皋嵐湘,鄧永江;乳腺癌中Vimentin與P-糖蛋白表達(dá)和其它預(yù)后指標(biāo)的相關(guān)性研究[J];中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2001年02期

6 馬文麗,薛社普;波形蛋白、核纖層蛋白與排核關(guān)系的研究[J];實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào);1994年03期

7 ;[J];;年期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 ;Epithelial-mesenchymal transition of oral epithelial cells immortalized by HPV16 E6 and E7[A];2004年上海市口腔醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2004年

2 ;Alterations in the intracellular Ca~(2+) concentration and vimentin in endothelial cells following tumor cell-endothelial cell interactions[A];中國(guó)藥理學(xué)會(huì)第十一屆全國(guó)化療藥理學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2012年

3 盧一平;楊立;;The Explorative Study of Expression and Drug Intervention of Vimentin, Anti-Vimentin antibodies, C4d in Chronic Allograft Nephropathy[A];第十五屆全國(guó)泌尿外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2008年

4 王，

本文編號(hào)：699049