本文關(guān)鍵詞：一個(gè)中國LHON大家系中新核修飾因子的發(fā)現(xiàn)與鑒定

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【摘要】：LHON是一種常見的線粒體母系遺傳視神經(jīng)病變,主要累及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,臨床主要表現(xiàn)為雙眼同時(shí)或先后發(fā)生急性或亞急性的視力減退,同時(shí)伴有中心視野缺失和色覺障礙,病理改變顯現(xiàn)為視盤周圍神經(jīng)纖維層腫脹和毛細(xì)血管擴(kuò)張。線粒體DNA的3個(gè)原發(fā)性突變(G11778A、G3460A、T14484C)是LHON的主要分子發(fā)病基礎(chǔ),卻不足以闡明LHON的不完全外顯、男性好發(fā)等特性,這表明LHON致病還受其它遺傳因素、環(huán)境因素的影響。不完全外顯和男性好發(fā)是LHON的兩大特性,也是目前亟待解決的難題。我們在研究中發(fā)現(xiàn)一個(gè)具有高外顯率(80%)、較低男女比率(1：1.7)LHON家系(WZ162家系),研究發(fā)現(xiàn)mtDNA繼發(fā)突變及其他相關(guān)突變可能對此家系LHON發(fā)病無重要作用,我們推測可能存在核基因突變影響此家系LHON高外顯率。為尋找與此家系發(fā)病相關(guān)的核修飾基因,我們選擇此家系一名攜帶者Ⅱ-10,三名患者Ⅱ-1、Ⅲ3、Ⅲ-6進(jìn)行全基因組外顯子測序,并從33例錯(cuò)義突變、9例插入缺失、4例剪切位點(diǎn)突變中篩選出一個(gè)核基因突變-PRICKLE3 c.157CT。此突變導(dǎo)致PRICKLE3蛋白第53位高度保守的精氨酸(R)變?yōu)樯彼?W),只存在WZ162家系的患者中,女性患者為雜合突變,男性患者為純合突變,家系內(nèi)正常對照及攜帶者均不含此突變,符合X連鎖的顯性遺傳模式。此外,此突變在篩查436位正常對照和179位來自55個(gè)LHON家系的母系成員與105位散發(fā)患者中均不存在。再通過Sanger測序?qū)RICKLE3基因的全外顯子區(qū)域進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)除c.157CT外,9個(gè)外顯子區(qū)域均不含其他突變。經(jīng)過定位分析,我們發(fā)現(xiàn)PRICKLE3蛋白部分位于線粒體內(nèi),可能與線粒體功能關(guān)聯(lián)。同時(shí)它在多種細(xì)胞及腦、肝臟、腎臟、肺、胎盤、胰臟等器官廣泛表達(dá)。為闡明PRICKLE3 c.157 CT突變對線粒體功能的影響,我們構(gòu)建了來自家系患者、攜帶者及正常對照的永生化淋巴細(xì)胞系,并進(jìn)行一系列與線粒體功能相關(guān)的生化檢測。生化檢測結(jié)果如下：(1)PRICKLE3蛋白表達(dá)檢測顯示粗提線粒體總蛋白中對照組、攜帶者組、患者組的相對表達(dá)量分別為0.90、0.82、0.91,細(xì)胞總蛋白中對照組、攜帶者組、患者組的相對表達(dá)量分別為1.11、1.26、1.15,三組相互比較無顯著差異(P0.05)。(2)線粒體呼吸鏈亞基蛋白表達(dá)檢測顯示患者組ATP6亞基的相對表達(dá)量顯著低于攜帶者組(P=0.01)和對照組(P=0.05),分別降低了35%、44%；ND4、ND5、ND6、CYTB、CO2亞基相對表達(dá)量三組間無顯著差異(P0.05)(3)細(xì)胞氧耗(OCR)實(shí)時(shí)測定發(fā)現(xiàn)患者組的基礎(chǔ)OCR、ATP產(chǎn)能相關(guān)OCR、最大呼吸OCR分別比對照組降低了52%、59%、52%(P0.01)；同時(shí)與攜帶者相比,患者組ATP產(chǎn)能相關(guān)OCR值下降幅度增大了24%(P0.05)。(4)ATP檢測發(fā)現(xiàn),與對照組相比較,患者組氧化磷酸化ATP產(chǎn)量減少了63%(P＜001),攜帶者組氧化磷酸化ATP產(chǎn)量減少了43%(P=0.05),患者組氧化磷酸化ATP產(chǎn)量的下降幅度增大了20%(P0.01),與患者組ATP6亞基的表達(dá)量降低及ATP產(chǎn)能相關(guān)OCR值下降幅度增大的結(jié)果一致。(5)膜電位檢測顯示攜帶者組和患者組線粒體膜電位低于對照組,差異顯著(P0.05),但患者組與攜帶者組相比較,膜電位相似,無顯著差異(P0.05)。(6)在H202刺激下,對照組、攜帶者組、患者組的ROS水平的平均值分別為1.68、2.12、2.55,患者組、攜帶者組ROS水平提高幅度均顯著大于對照組(P0.05)；但患者組與攜帶者組相比較,ROS水平無明顯提高(P0.05)。通過以上檢測和分析,我們在WZ162家系發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的核基因突變位點(diǎn)PRICKLE3 c.157CT。該突變符合X-連鎖顯性遺傳模式,在淋巴細(xì)胞系中可促進(jìn)線粒體ATP的產(chǎn)能降低,可能影響此家系外顯率。但PRICKLE3 c.157CT影響線粒體產(chǎn)能、調(diào)控LHON發(fā)病具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：LHON 外顯子測序 PRICKLE3 核修飾因子
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R774.6
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-14
• 1 引言14-28
• 1.1 線粒體與線粒體疾病14-16
• 1.1.1 線粒體的功能及調(diào)控14-15
• 1.1.2 線粒體疾病遺傳模式及發(fā)病特點(diǎn)15-16
• 1.2 LHON的研究現(xiàn)狀16-21
• 1.2.1 LHON的發(fā)現(xiàn)歷史16
• 1.2.2 與LHON相關(guān)的原發(fā)性突變16-17
• 1.2.3 LHON臨床表現(xiàn)及診治17-18
• 1.2.4 影響LHON發(fā)病的因素18-21
• 1.3 二代測序技術(shù)與新致病基因的發(fā)現(xiàn)21-27
• 1.3.1 第二代測序技術(shù)的發(fā)展21
• 1.3.2 全基因組外顯子測序與致病基因的發(fā)現(xiàn)21-23
• 1.3.3 全基因組外顯子測序的基本思路及技術(shù)路線23-27
• 1.4 本課題的研究思路27-28
• 2 實(shí)驗(yàn)材料與方法28-44
• 2.1 臨床樣本28-29
• 2.1.1 樣本來源及細(xì)胞株簡介28
• 2.1.2 家系譜系28-29
• 2.1.3 臨床資料及照片29
• 2.2 研究試劑29-31
• 2.2.1 化學(xué)試劑29-30
• 2.2.2 化學(xué)試劑試劑盒30
• 2.2.3 抗體30-31
• 2.3 主要儀器及器材31
• 2.4 常用試劑溶液及培養(yǎng)基的配制31-33
• 2.4.1 感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化試劑31-32
• 2.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)基32
• 2.4.3 血液DNA提取所用試32
• 2.4.4 聚丙烯酰胺凝膠貯存液的配制32
• 2.4.5 淋巴細(xì)胞建系試劑32
• 2.4.6 OCR測定所用試劑32-33
• 2.4.7 ATP測定所用試劑33
• 2.5 引物33-34
• 2.5.1 擴(kuò)線粒體全序引物33
• 2.5.2 PRICKLE3外顯子篩查所用引物33-34
• 2.5.3 酶切鑒定PRICK-LE3 157位點(diǎn)PCR擴(kuò)增引物34
• 2.5.4 鑒定PRICKLE3表達(dá)QPCR擴(kuò)增引物34
• 2.6 實(shí)驗(yàn)方法34-44
• 2.6.1 血液DNA的提取方法34-35
• 2.6.2 PCR擴(kuò)增及酶切鑒定、測序35-36
• 2.6.3 熒光定量PCR36-37
• 2.6.4 PRICKLE3蛋白細(xì)胞定位37-38
• 2.6.5 線粒體提取38-39
• 2.6.6 永生化淋巴細(xì)胞系的建立39
• 2.6.7 Western Blot檢測蛋白表達(dá)39-41
• 2.6.8 OCR測定41-42
• 2.6.9 ATP測定42-43
• 2.6.10 ROS測定43
• 2.6.11 線粒體膜電位的測定43-44
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-65
• 3.1 WZ162家系分析44
• 3.2 WZ162家系全基因組外顯子測序結(jié)果44-56
• 3.2.1 原始數(shù)據(jù)概況44-46
• 3.2.2 目標(biāo)區(qū)域內(nèi)每個(gè)樣本的測序深度情況46
• 3.2.3 樣本的目標(biāo)區(qū)域內(nèi)外顯子捕獲測序的均一性46-47
• 3.2.4 CCDS外顯子的測序深度和覆蓋度47
• 3.2.5 全基因組外顯子測序數(shù)據(jù)SNP的檢測與注釋47-48
• 3.2.6 插入/缺失(indels)注釋48-49
• 3.2.7 基因突變分析49-56
• 3.3 PRICKLE3蛋白定位56-57
• 3.4 PRICKLE3基因組織表達(dá)情況57-58
• 3.5 PRICKLE3蛋白表達(dá)檢測58-59
• 3.6 呼吸鏈亞基表達(dá)檢測59-60
• 3.7 OCR檢測、ATP檢測60-62
• 3.8 線粒體ROS、膜電位檢測62-65
• 4 討論65-67
• 5 展望67-68
• 參考文獻(xiàn)68-75
• 簡歷75

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