發(fā)布時間：2017-08-14 03:17

  本文關(guān)鍵詞：介孔二氧化硅納米載體介導(dǎo)南蛇藤素抗喉癌作用的研究

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【摘要】：背景:喉癌是頭頸部常見的腫瘤之一,近年來,其發(fā)病率有逐漸上升的趨勢。目前,臨床治療喉癌的首選方法是手術(shù)治療,但易造成喉功能喪失;喉癌對化療敏感性低,易產(chǎn)生多藥耐藥;放療毒副作用大。因此,迫切尋找更高效的治療方法。傳統(tǒng)中藥材雷公藤被用于治療自身免疫病、慢性炎癥、哮喘和慢性神經(jīng)性疾病已有幾百年的歷史。近來,人們發(fā)現(xiàn)從雷公藤根部提取出來的一種三萜類化合物南蛇藤素,能抑制多種腫瘤細(xì)胞系的增殖能力。然而,南蛇藤素的水溶性極低,口服生物利用度不高;對腫瘤細(xì)胞的特異性選擇差,有效治療劑量與中毒劑量非常接近;這些缺點限制了南蛇藤素作為抗腫瘤藥物的臨床應(yīng)用。新型納米藥物遞送體為解決以上難題提供了新的思路,其中介孔二氧化硅納米粒子(MSNs)載體因其無毒、良好的生物相容性和可生物降解性,被國、內(nèi)外學(xué)者推崇為藥物遞送研發(fā)平臺的極佳載體。本課題擬構(gòu)建負(fù)載有南蛇藤素的介孔二氧化硅納米粒子載藥系統(tǒng)(MSNs-celastrol),通過對比南蛇藤素裸藥(celastrol),研究MSNs裝載南蛇藤素的理化特征以及MSNs-celastrol對人喉癌HEp-2細(xì)胞體內(nèi)、外的抗腫瘤效果。方法:1.通過化學(xué)合成介孔二氧化硅納米粒子(MSNs)載體,應(yīng)用透射電鏡和掃描電鏡對MSNs的粒徑、結(jié)構(gòu)、分散性等理化性質(zhì)進(jìn)行計算與分析。2.用3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)將MSNs的骨架結(jié)構(gòu)修飾氨基,增強(qiáng)了MSNs載體與南蛇藤素分子結(jié)構(gòu)的羧基間靜電相互吸引能力,提高M(jìn)SNs對南蛇藤素的負(fù)載效率和載藥量。用紫外分光光度計測定初始南蛇藤素濃度和未負(fù)載入MSNs載體的南蛇藤素濃度,通過差量法計算MSNs裝載南蛇藤素的載藥效率和載藥量;為模擬體內(nèi)血液環(huán)境,用胎牛血清(FBS)作為MSNs-celastrol釋放南蛇藤素的釋放介質(zhì),進(jìn)行體外藥物釋放實驗。3.通過體外實驗,探討南蛇藤素裸藥和MSNs-celastrol載藥系統(tǒng)對人喉癌HEp-2細(xì)胞的細(xì)胞活力、周期、自噬和凋亡的影響;通過體內(nèi)實驗建立人喉癌HEp-2細(xì)胞的移植瘤模型,分析南蛇藤素裸藥和MSNs-celastrol載藥系統(tǒng)對裸鼠移植瘤的治療效果。4.通過western blot探討MSNs-celastrol抑制喉癌生長的分子機(jī)制。5.通過體外CCK-8實驗檢測不同濃度的MSNs載體對HEp-2細(xì)胞的細(xì)胞毒性;體內(nèi)動物實驗:觀察負(fù)載南蛇藤素的MSNs載體在治療喉癌移植瘤過程中對小鼠飲食、活動、精神狀態(tài)的影響,監(jiān)測荷瘤小鼠體重變化,HE染色觀察治療結(jié)束后小鼠主要臟器的組織學(xué)變化,評估MSNs載體的生物相容性。結(jié)果:1.MSNs的合成及表征TEM結(jié)果顯示:合成的MSNs有許多排列有序的孔道;SEM結(jié)果顯示:合成的MSNs呈較均勻規(guī)整的球形,分散性好;動態(tài)光散射(DLS)粒徑分析結(jié)果顯示:MSNs的粒徑為30nm±2.2nm。2.載藥量及藥物釋放率的測定MSNs因具有巨大比表面積和高比孔容性,可將南蛇藤素負(fù)載在其孔道內(nèi),但初試結(jié)果顯示MSNs負(fù)載南蛇藤素效率不高。為增加與南蛇藤素載藥量,我們用3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)對介孔硅納米粒子結(jié)構(gòu)骨架進(jìn)行氨基修飾,結(jié)果藥物包封率達(dá)50%±3.4%,載藥量2.5%。體外藥物釋放實驗顯示MSNs-celastrol載藥系統(tǒng)具有良好的藥物緩釋效果:4h內(nèi)南蛇藤素累積釋放率為22%左右,未出現(xiàn)暴釋效應(yīng),滿足中國藥典的規(guī)定;24h~96h藥物呈緩慢持續(xù)釋放,100h以后藥物釋放達(dá)80%,藥物釋放基本完全。3.MSNs-celastrol載藥系統(tǒng)抗腫瘤作用評價體外實驗結(jié)果顯示:在相同的藥物濃度下,MSNs-celastrol載藥系統(tǒng)比南蛇藤素裸藥對HEp-2細(xì)胞的生長抑制更顯著,導(dǎo)致HEp-2細(xì)胞周期阻滯在G2/M期,具有誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡作用。體內(nèi)實驗顯示:MSNs-celastrol載藥組和南蛇藤素裸藥組對荷瘤裸鼠的抑瘤率分別為82.6%和78.5%;然而,南蛇藤素裸藥組的小鼠體重相對給藥前減少9.7%,對照組和MSNs-celastrol載藥組小鼠體重分別增加17.8%和4.5%。荷瘤裸鼠腫瘤組織免疫組化結(jié)果顯示:相對等劑量南蛇藤素裸藥組,MSNs-celastrol載藥組小鼠腫瘤組織中的Ki67陽性細(xì)胞率更低,TUNEL陽性率更高。4.MSNs-celastrol載藥系統(tǒng)抗腫瘤機(jī)制的研究體外實驗:將MSNs-celastrol作用于HEp-2細(xì)胞,Western blot實驗結(jié)果表明MSNs負(fù)載的南蛇藤素對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白、自噬相關(guān)蛋白在HEp-2細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)具有明顯的誘導(dǎo)作用。同樣裸鼠腫瘤組織蛋白的Western blot結(jié)果顯示MSNs-celastrol載藥組小鼠腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)亦增強(qiáng),與體外實驗結(jié)果相符。5.MSNs生物相容性分析體外CCK-8實驗顯示不同濃度(31~250μg/m L)的MSNs并不影響腫瘤細(xì)胞的活力,體內(nèi)實驗MSNs負(fù)載的南蛇藤素低濃度組(MSNs的濃度為20mg/kg)和MSNs負(fù)載的南蛇藤素高濃度組(MSNs的濃度為35mg/kg)在治療過程中,并未使裸鼠的體重減輕。HE染色結(jié)果顯示:注射MSNs-cel.1.75mg/kg組和對應(yīng)的MSNs載體組的小鼠各臟器內(nèi)均未觀察到炎癥細(xì)胞浸潤和細(xì)胞損傷的形態(tài)學(xué)變化。提示MSNs-celastrol的生物學(xué)作用是負(fù)載的南蛇藤素引起的,并且在MSNs所使用的劑量范圍和時間內(nèi),我們沒有發(fā)現(xiàn)MSNs本身對機(jī)體引起任何損傷。結(jié)論:1.成功合成粒徑30nm左右,分散性好,穩(wěn)定性較高,可裝載并緩釋南蛇藤素的MSNs載體。2.MSNs具有較好的生物相容性。3.構(gòu)建的MSNs-celastrol載藥系統(tǒng)增強(qiáng)南蛇藤素靶向性,提高了南蛇藤素的生物利用度,增強(qiáng)了南蛇藤素抗腫瘤作用,同時,降低了南蛇藤素的毒副作用;這種抗腫瘤作用是通過增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡。
【關(guān)鍵詞】：喉癌 疏水性 南蛇藤素 介孔二氧化硅納米粒子 藥物遞送體
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.65
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-15
• 第1章 緒論15-24
• 1.1 南蛇藤素藥理作用的研究現(xiàn)狀15
• 1.2 提高南蛇藤素水溶性的方法15-16
• 1.3 MSNS作為新型納米藥物遞送載體的研究16-20
• 1.3.1 MSNs的合成16-18
• 1.3.2 MSNs作為納米藥物遞送體的優(yōu)點18
• 1.3.3 MSNs作為藥物載體的發(fā)展進(jìn)程18-20
• 1.4 MSNS作為新型藥物遞送系統(tǒng)面臨的挑戰(zhàn)20-22
• 1.5 本論文的研究目的及思路22-24
• 第2章 實驗部分24-34
• 2.1 實驗材料24-25
• 2.2 實驗方法25-34
• 2.2.1 MSNs的合成25
• 2.2.2 MSNs形態(tài)和尺寸表征25-26
• 2.2.3 熒光標(biāo)記MSNs26
• 2.2.4 細(xì)胞對F-MSNs的內(nèi)吞過程26
• 2.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)F-MSNs的熒光強(qiáng)度26-27
• 2.2.6 MSNs載藥和釋藥測定27-28
• 2.2.7 透射電鏡觀察MSNs在細(xì)胞內(nèi)的分布28
• 2.2.8 CCk-8 檢測細(xì)胞活性28-29
• 2.2.9 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期29
• 2.2.10 AnnexinV/PI檢測細(xì)胞凋亡29
• 2.2.11 western blot檢測蛋白的表達(dá)情況29-30
• 2.2.12 裸鼠皮下移植瘤模型建立30
• 2.2.13 分組及給藥治療30
• 2.2.14 組織學(xué)分析30-32
• 2.2.15 Western blot檢測腫瘤組織相關(guān)抗原的表達(dá)32
• 2.2.16 ICP-AES檢測MSNs在小鼠體內(nèi)的分布32-33
• 2.2.17 數(shù)據(jù)分析33-34
• 第3章 結(jié)果34-50
• 3.1 MSNS的合成34
• 3.2 MSNS的表征34
• 3.3 MSNS的粒徑分析34-35
• 3.4 MSNS載藥量及藥物釋放率的測定35-36
• 3.5 MSNs-celastrol體外抗腫瘤效果評價36-40
• 3.5.1 MSNs-celastrol對HEp-2 細(xì)胞活力的影響36-37
• 3.5.2 MSNs-celastrol對HEp-2 細(xì)胞細(xì)胞周期的影響37-38
• 3.5.3 MSNs-celastrol誘導(dǎo)HEp-2 細(xì)胞凋亡38-39
• 3.5.4 MSNs-celastrol誘導(dǎo)HEp-2 細(xì)胞自噬39-40
• 3.6 MSNs-celastrol體外抗腫瘤作用機(jī)制的研究40-43
• 3.6.1 細(xì)胞對MSNs的攝取40-42
• 3.6.2 透射電鏡觀察MSNs在細(xì)胞的定位42
• 3.6.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平檢測42-43
• 3.7 MSNs-celastrol治療裸鼠移植瘤的效果評價43-48
• 3.7.1 荷瘤裸鼠腫瘤生長情況及體重變化的監(jiān)測43-45
• 3.7.2 荷瘤裸鼠腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡情況45-46
• 3.7.3 荷瘤裸鼠腫瘤組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平檢測46-48
• 3.8 MSNS的組織相容性分析48
• 3.9 MSNS在小鼠體內(nèi)的分布48-50
• 第4章 討論50-56
• 4.1 MSNs-celastrol能發(fā)揮更高效抗腫瘤作用51-53
• 4.2 MSNs-celastrol降低南蛇藤素毒副作用53-54
• 4.3 MSNS具有較好的生物相容性和生物可降解性54-56
• 第5章 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-62
• 作者簡介及碩士期間研究成果62-63
• 致謝63

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號：670474