本文關(guān)鍵詞：真菌性角膜炎中NETs的形成及糖皮質(zhì)激素對(duì)其影響的研究

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【摘要】：研究背景真菌性角膜炎是致盲率很高的感染性眼病,在我國(guó)居感染性角膜病致盲率的首位[11。近年來(lái)由于廣譜抗生素及皮質(zhì)類(lèi)固醇激素的廣泛使用,長(zhǎng)期使用免疫抑制劑,角膜接觸鏡的佩戴增加,眼部手術(shù)的增加,其患病率有增加的趨勢(shì)。外傷一直是真菌性角膜炎的主要誘因,特別是植物性外傷。引起角膜炎的真菌菌屬在不同國(guó)家、不同地區(qū)、不同年代均有差別,總的來(lái)說(shuō),在發(fā)達(dá)地區(qū)和較寒冷地區(qū)常見(jiàn)致病菌為白色念珠菌,在發(fā)展中國(guó)家和氣候溫暖或炎熱的地方,主要是鐮刀菌和曲霉菌[3]。真菌性角膜炎可導(dǎo)致嚴(yán)重的角膜潰瘍甚至角膜穿孔、眼內(nèi)炎等并發(fā)癥,常常危及整個(gè)眼球。目前真菌性角膜炎的致盲率及致殘率居高不下,究其原因：一方面,由于目前尚缺乏廣譜、高效、低毒的抗真菌藥物；另一方面,由于真菌性角膜炎的臨床表現(xiàn)較為復(fù)雜往往不能得到早期診斷治療；并且,早期易被誤診為細(xì)菌性角膜炎或病毒性角膜炎,導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素的不合理使用,從而延誤治療,加重了病情。目前研究認(rèn)為糖皮質(zhì)激素一方面可增加真菌在角膜中的繁殖力和侵襲力,加速真菌的生長(zhǎng)力,另一方面抑制蛋白合成促進(jìn)蛋白分解而延長(zhǎng)病損角膜的修復(fù)周期,加重真菌性角膜炎的病情。另外有研究者發(fā)現(xiàn),在有效的抗真菌治療下,疾病后期局部應(yīng)用大劑量的激素則可阻止機(jī)體過(guò)強(qiáng)的免疫反應(yīng),減少新生血管和角膜混濁。目前糖皮質(zhì)激素對(duì)真菌性角膜炎的影響機(jī)理尚不清楚,所以應(yīng)從真菌性角膜炎基礎(chǔ)研究入手,探究糖皮質(zhì)激素的免疫調(diào)控機(jī)制,從而指導(dǎo)臨床更加合理地使用糖皮質(zhì)激素,達(dá)到既能有效控制感染又減少組織損傷的目的。固有免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵御致病菌入侵的第一道防線,在感染早期擔(dān)任限制病原體擴(kuò)散的重要作用。中性粒細(xì)胞作為固有免疫系統(tǒng)重要成員,研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥或感染時(shí),中性粒細(xì)胞首先募集至炎癥、感染部位,主要通過(guò)吞噬作用,產(chǎn)生活性氧,及脫顆粒釋放抗菌肽殺傷病原體,同時(shí)產(chǎn)生一些炎癥因子趨化更多的炎癥細(xì)胞[6]。這些作用一方面能夠有效地殺滅病原體,對(duì)早期感染的控制具有重要意義,但另一方面釋放多種生物活性介質(zhì),導(dǎo)致強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)造成自身組織的損傷,在角膜炎中,引起角膜的炎癥反應(yīng),新生血管、疤痕的形成,甚至角膜穿孔等嚴(yán)重后果。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn),中性粒細(xì)胞還可以通過(guò)一種稱之為中性粒細(xì)胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)的新機(jī)制殺滅病原菌,與經(jīng)典的吞噬作用殺滅病原菌胞內(nèi)途徑明顯不同,NETs是中性粒細(xì)胞通過(guò)胞外途徑來(lái)殺滅病原菌。中性粒細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞核常染色質(zhì)和異染色質(zhì)均質(zhì)化、核膜和顆粒膜破裂,核內(nèi)物質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)的物質(zhì)混合,最后階段細(xì)胞膜的破裂,混合物在胞外形成一種以DNA為骨架結(jié)合一些抗菌蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),即NETs結(jié)構(gòu)[9].NETs的形成過(guò)程與細(xì)胞凋亡及細(xì)胞死亡有明顯的區(qū)別,為一種新的程序性細(xì)胞死亡,現(xiàn)將其命名為NETosis[10]。 NETs通過(guò)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)對(duì)病原菌進(jìn)行包圍限制其擴(kuò)散,再通過(guò)其上附著的高濃度的組蛋白、鈣網(wǎng)蛋白、蛋白酶G等抗菌蛋白對(duì)病原體進(jìn)行殺滅。目前在許多炎癥、感染性疾病中發(fā)現(xiàn)NETs的形成,提示其在炎癥、感染性疾病中發(fā)揮著重要的作用,另外,越來(lái)越多的研究表明過(guò)度地產(chǎn)生NETs將會(huì)導(dǎo)致炎癥持續(xù)存在,以及造成機(jī)體本身的組織損傷,NETs量的多少與炎癥反應(yīng)誘發(fā)的二次損傷發(fā)生有著緊密的聯(lián)系。但是,由于角膜缺乏血管,NETs形成后的轉(zhuǎn)歸仍不得而知,我們推測(cè)由于角膜缺乏血管,NETs更易積存,可能與角膜炎感染控制后的炎癥反應(yīng)、角膜自溶及角膜疤痕形成有關(guān)。鑒于NETs的雙重性作用,如何通過(guò)對(duì)NETs形成的干預(yù)與調(diào)控來(lái)影響感染的控制和預(yù)后具有重要的臨床意義。糖皮質(zhì)激素強(qiáng)大的抗炎及免疫抑制作用,NETs作為中性粒細(xì)胞重要的殺菌模式,糖皮質(zhì)激素是否通過(guò)影響NETs的形成而影響真菌性角膜炎的病情,如果能揭示糖皮質(zhì)激素與NETS之間的某些聯(lián)系,那么局部合理地使用糖皮質(zhì)激素,或許能夠達(dá)到既有效控制感染又減少組織損傷的目的。本研究圍繞這一目的分兩步走,首先通過(guò)建立模擬真菌性角膜炎自然感染過(guò)程的小鼠真菌性角膜炎動(dòng)物模型,觀察真菌性角膜炎動(dòng)物模型的自然發(fā)展過(guò)程,及自然發(fā)展過(guò)程中NETs在真菌性角膜炎中的作用,并在角膜炎發(fā)展的不同階段行組織病理學(xué)檢查,觀察角膜炎發(fā)展過(guò)程中角膜組織內(nèi)真菌病原體的繁殖情況,進(jìn)一步研究糖皮質(zhì)激素對(duì)實(shí)驗(yàn)性真菌性角膜炎的臨床表現(xiàn)、組織病理學(xué)表現(xiàn)、以及NETs形成的影響,探究糖皮質(zhì)激素是否通過(guò)影響NETs的形成而影響真菌性角膜炎的病程。以期增加我們對(duì)糖皮質(zhì)激素影響真菌性角膜炎發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí),從而為臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究目的評(píng)價(jià)NETs在真菌性角膜炎中的作用,探討糖皮質(zhì)激素是否通過(guò)干預(yù)NETs的形成影響真菌性角膜炎的病程。研究方法選用相同周齡的C57BL/6小鼠,采用角膜表層鏡片法建立小鼠真菌性角膜炎模型,隨機(jī)將動(dòng)物模型分為白色念珠菌性角膜炎未干預(yù)組,地塞米松組、及損傷對(duì)照組。白色念珠性角膜炎未干預(yù)組及地塞米松處理組均接種白色念珠菌(麥?zhǔn)蠞岫?0.7),損傷對(duì)照組均接種生理鹽水。接種48小時(shí)后拆線,地塞米松組給予0.1%地塞米松磷酸鈉溶液滴眼,1滴/次,3次/天,連續(xù)點(diǎn)3天,未干預(yù)組給予生理鹽水,1滴/次,3次/天,連續(xù)點(diǎn)3天。每天進(jìn)行裂隙燈檢查,采集圖片,并進(jìn)行臨床評(píng)分,角膜刮片進(jìn)行免疫熒光染色觀察潰瘍物中菌絲、中性粒細(xì)胞及NETs的變化情況,在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行受染角膜組織中真菌負(fù)荷量的計(jì)算,及病理學(xué)檢查受染角膜組織中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和真菌的生長(zhǎng)情況,另外進(jìn)行掃描電鏡觀察NETs的形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的變化。比較地塞米松組與未干預(yù)組之間的差異。所有的數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,采用非參數(shù)檢驗(yàn)中Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P0.05為差異有顯著意義。(以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn))。結(jié)果1.角膜表層鏡片法可以成功建立典型的小鼠真菌性角膜炎模型。病灶內(nèi)大量浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞形成致密的NETs,網(wǎng)捕白色念珠菌限制其擴(kuò)散。2.地塞米松組小鼠病情進(jìn)展加快,病情加重,病程延長(zhǎng),10天內(nèi)角膜炎臨床評(píng)分明顯高于未干預(yù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Zd1=0.00,P=1.0;Zd3=-2.02,P=0.043;Zd5=-5.23,P=0.00,Zd7=-7.10,P=0.00::Zd10=-7.21,P=0.00)。病理檢查及角膜組織勻漿培養(yǎng)均顯示地塞米松組角膜內(nèi)真菌負(fù)荷量明顯多于未干預(yù)組(D3地帶米松組1616.67±169.29CFU/cornea未干預(yù)組766.67±289.76CFU/cornea;).地塞米松組真菌生長(zhǎng)速度加快,菌絲增長(zhǎng)增粗,侵襲力增加,但是病灶內(nèi)菌絲集中區(qū)卻缺乏中性粒細(xì)胞。掃描電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),使用激素后,角膜表面形成致密的菌絲苔被,苔被下大量菌絲,但浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞較少,菌絲周?chē)鶱ETs結(jié)構(gòu)較未干預(yù)組網(wǎng)狀纖維稀疏,網(wǎng)狀纖維上附著的顆粒蛋白也較少。結(jié)論1.真菌性角膜炎中中性粒細(xì)胞能通過(guò)形成NETs捕獲真菌,在抗感染過(guò)程中NETs與吞噬作用同時(shí)存在共同防御真菌感染。2.糖皮質(zhì)激素能夠減少角膜中中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn),減少NETs的形成,減弱NETs的殺菌能力,同時(shí)激素能促進(jìn)白色念珠菌的生長(zhǎng),增強(qiáng)其侵襲力,從而加重真菌性角膜炎病情,延遲愈合,延長(zhǎng)病程。
【關(guān)鍵詞】：真菌性角膜炎 糖皮質(zhì)激素 中性粒細(xì)胞胞外陷阱
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R772.21
【目錄】：

• 致謝4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 1. 前言15-17
• 2. 材料與方法17-23
• 3. 結(jié)果23-38
• 4. 討論38-43
• 5. 小結(jié)43-44
• 參考文獻(xiàn)44-48
• 綜述48-67
• 參考文獻(xiàn)59-67
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷67-68

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：638628