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二維和三維誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞來(lái)源RPE細(xì)胞的生物學(xué)特性比較研究

發(fā)布時(shí)間:2017-08-07 01:05

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【摘要】:研究背景和目的視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)是由視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)細(xì)胞和視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞變性引起的遺傳性致盲眼病。目前,RP的治療尚沒(méi)有明確有效的方法。RPE細(xì)胞移植是目前治療RP最有遠(yuǎn)大前景的治療方法。用于移植的RPE細(xì)胞大多來(lái)源于早期自體和同種異體RPE細(xì)胞及胚胎RPE細(xì)胞[1-5],存在細(xì)胞來(lái)源受限、RPE細(xì)胞活性差、免疫排斥反應(yīng)及嚴(yán)重手術(shù)并發(fā)癥等諸多問(wèn)題,限制了其臨床推廣。近年來(lái)多能干細(xì)胞來(lái)源的RPE細(xì)胞因其來(lái)源廣泛、生物學(xué)特性良好而漸漸成為RPE細(xì)胞移植的主要來(lái)源。2012年和2015年Schwartz等[6,7]兩次報(bào)告使用人胚胎干細(xì)胞(Human embryonic stem cells,hESCs)來(lái)源的RPE細(xì)胞(通過(guò)自發(fā)分化方法,本文以下統(tǒng)稱為二維誘導(dǎo)分化法)移植治療兩類視網(wǎng)膜變性疾病:年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)和Stargardt黃斑營(yíng)養(yǎng)不良,均證實(shí)了hESCs來(lái)源的RPE細(xì)胞的安全性和有效性,這是hESCs來(lái)源的RPE細(xì)胞臨床移植的首次報(bào)道,揭開(kāi)了人胚胎干細(xì)胞臨床轉(zhuǎn)化研究的序幕。胚胎干細(xì)胞分化為RPE細(xì)胞有多種方法,各方法誘導(dǎo)得到的RPE細(xì)胞的純度、活性、功能以及獲得的效率都有很大差別。近年來(lái)采用無(wú)血清培養(yǎng),可將小鼠或人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的擬胚體(Embryoid bodies,EBs)樣聚集體在特制的V字底培養(yǎng)皿結(jié)合基質(zhì)膠培養(yǎng)條件下快速再聚集,配合低濃度生長(zhǎng)因子,可以有效地促進(jìn)ESCs向類器官發(fā)育[8,9]。從這類胚胎干細(xì)胞來(lái)源的類器官中可以獲得包括RPE細(xì)胞在內(nèi)的各類治療細(xì)胞。由于這種全新的三維誘導(dǎo)分化法模擬了器官的體內(nèi)發(fā)育過(guò)程,從這種誘導(dǎo)方法得到的治療細(xì)胞被認(rèn)為可能具有更好的生物學(xué)特性、更接近原代分離的治療細(xì)胞,但目前尚未見(jiàn)將hESCs經(jīng)傳統(tǒng)的二維誘導(dǎo)分化法和經(jīng)上述三維誘導(dǎo)分化法得到的RPE細(xì)胞(即2D-RPE和3D-RPE細(xì)胞)的生物學(xué)特性進(jìn)行系統(tǒng)比較研究的相關(guān)報(bào)道。本研究擬首先建立hESCs的三維視泡視杯誘導(dǎo)方法,從中分離出RPE細(xì)胞,觀察RPE細(xì)胞的三維誘導(dǎo)分化過(guò)程并進(jìn)行生物學(xué)鑒定,并與傳統(tǒng)的二維誘導(dǎo)分化法獲得的hESCs來(lái)源的RPE細(xì)胞在成熟度、細(xì)胞功能、移植后對(duì)變性視網(wǎng)膜的保護(hù)功能等方面進(jìn)行比較,以明確三維誘導(dǎo)分化法獲得RPE細(xì)胞的特性,為臨床選擇合適的誘導(dǎo)方式提供依據(jù)。方法1、二維分化法誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(2D-RPE細(xì)胞)(1)H1人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定;(2)2D-RPE細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化研究;(3)2D-RPE細(xì)胞免疫熒光鑒定,通過(guò)分析Bestrophin、CRALBP、MITF和PAX6特異性標(biāo)記物的表達(dá),鑒定2D-RPE的成熟程度。2、三維法誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(3D-RPE細(xì)胞)(1)3D-RPE細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化研究;(2)3D-RPE細(xì)胞免疫熒光鑒定,通過(guò)研究Bestrophin、CRALBP、MITF和PAX6特異性標(biāo)記物的表達(dá),鑒定3D-RPE的成熟程度。3、比較3D-RPE和2D-RPE細(xì)胞的生物學(xué)特性(1)免疫熒光染色比較3D-RPE和2D-RPE細(xì)胞在誘導(dǎo)40d、60d和100d后細(xì)胞PAX6的表達(dá)差異,并比較PAX6陽(yáng)性細(xì)胞率,以比較3D-RPE和2D-RPE中RPE前體細(xì)胞的陽(yáng)性率差異。(2)通過(guò)免疫熒光染色和免疫印跡法,比較3D-RPE和2D-RPE細(xì)胞在誘導(dǎo)40d、60d和100d后成熟RPE細(xì)胞標(biāo)記RPE65的表達(dá)情況,以明確兩種不同誘導(dǎo)方法中成熟RPE細(xì)胞的比例差異。4、觀察3D-RPE和2D-RPE細(xì)胞移植慢性視網(wǎng)膜色素變性大鼠模型(Royal college of surgeon,RCS)后的安全性和有效性(1)通過(guò)Ki67、mitochondrial和Dil共標(biāo)記移植后4w的細(xì)胞,觀察細(xì)胞在體內(nèi)的增殖情況;將3D-RPE、2D-RPE細(xì)胞和hESC細(xì)胞分別移植SCID免疫缺陷小鼠腹股溝兩側(cè)皮下,每周觀察皮下情況至4個(gè)月,觀察畸胎瘤的形成情況。(2)通過(guò)RPE65、mitochondrial和Dil共標(biāo)記移植RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔后4w的3D-RPE和2D-RPE細(xì)胞,觀察細(xì)胞在體內(nèi)的存活情況;同時(shí)采用Rhodopsin染色測(cè)量移植3D-RPE和2D-RPE細(xì)胞后4w、8w和12w RCS大鼠視網(wǎng)膜的外核層厚度、ERG電生理檢測(cè)b波幅值,以分析3D-RPE和2D-RPE細(xì)胞移植對(duì)變性視網(wǎng)膜保護(hù)作用的差異。結(jié)果H1的鑒定(1)hESCs傳代后第一天,細(xì)胞單個(gè)或多個(gè)生長(zhǎng),細(xì)長(zhǎng)呈分支狀;第二天換去含Y-27632的培養(yǎng)液后,hESC細(xì)胞呈小克隆成團(tuán)生長(zhǎng)并逐漸增大,克隆團(tuán)之間逐漸接觸融合;(2)培養(yǎng)的hESCs表達(dá)胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)記物Nanog、SSEA-4、SOX2和OCT4,除SSEA-4表達(dá)在hESC細(xì)胞膜上外,其余胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物均表達(dá)在細(xì)胞核,陽(yáng)性率均在99%以上。2、hESCs經(jīng)二維誘導(dǎo)和三維誘導(dǎo)分化為RPE細(xì)胞的過(guò)程和形態(tài)比較(1)hESCs通過(guò)二維誘導(dǎo)和三維誘導(dǎo)分化法向RPE細(xì)胞分化,誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)程和所得的RPE細(xì)胞形態(tài)相似,20d在2D和3D培養(yǎng)誘導(dǎo)體系中都可以觀察到少量棕褐色的色素灶出現(xiàn)并逐漸增多增大,顏色由淺至深;挑出的RPE細(xì)胞在60d均呈典型的六角鵝卵石樣上皮細(xì)胞形態(tài),呈單層片狀,富含色素顆粒,細(xì)胞排列整齊且連接緊密;(2)3D-RPE和2D-RPE細(xì)胞誘導(dǎo)后60d均表達(dá)RPE特異性細(xì)胞標(biāo)記物Bestrophin、CRALBP、MITF和PAX6,Bestrophin和CRALBP主要表達(dá)在RPE細(xì)胞膜上,少量細(xì)胞漿著色,整個(gè)RPE細(xì)胞出現(xiàn)較規(guī)則的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。MITF和PAX6定位于RPE細(xì)胞核,陽(yáng)性率均在99%以上;在誘導(dǎo)后40d、60d和100d,3D-RPE中PAX6陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性率維持時(shí)間較2D-RPE更長(zhǎng),而RPE65在3D-RPE細(xì)胞中出現(xiàn)時(shí)間較2D-RPE細(xì)胞晚;提示3D-RPE較2D-RPE成熟更晚。(3)hESC經(jīng)三維分化法形成的視泡樣結(jié)構(gòu)經(jīng)切片染色,可在該結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層和色素上皮細(xì)胞的標(biāo)記物PAX6、CRALBP,并在該結(jié)構(gòu)的外層發(fā)現(xiàn)呈單層的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞,該結(jié)構(gòu)內(nèi)層部分為多層視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮細(xì)胞,提示hESC經(jīng)三維分化可形成類似視杯的結(jié)構(gòu),該誘導(dǎo)過(guò)程類似視網(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程;3、3D-RPE和2D-RPE細(xì)胞移植的安全性及對(duì)RCS大鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用(1)3D-RPE和2D-RPE細(xì)胞皮下注入重度結(jié)合免疫缺陷(SCID)小鼠腹股溝兩側(cè),隨訪4個(gè)月里未發(fā)現(xiàn)在皮下形成包塊,而陽(yáng)性對(duì)照組的hESC細(xì)胞在注射后1個(gè)月在腹股溝出現(xiàn)明顯的皮下包塊,提示3D-RPE和2D-RPE無(wú)成瘤性。(2)3D-RPE和2D-RPE細(xì)胞移植到RSC變性大鼠視網(wǎng)膜下腔4w后,植入細(xì)胞可以形成單層,這些植入細(xì)胞人類線粒體和Dil細(xì)胞紅色標(biāo)記共表達(dá),提示移植細(xì)胞可以存活,未發(fā)現(xiàn)明顯的排斥反應(yīng);(3)植入的3D-RPE和2D-RPE細(xì)胞在4w時(shí),Ki67均為陰性,提示移植細(xì)胞在體內(nèi)處于靜止期,并沒(méi)有繼續(xù)增殖;(4)體外實(shí)驗(yàn)3D-RPE-60D細(xì)胞不表達(dá)RPE65,而2D-RPE-60D細(xì)胞RPE65呈陽(yáng)性。3D-RPE-60D和2D-RPE-60D細(xì)胞移植到RSC變性大鼠視網(wǎng)膜下腔4w后均能共表達(dá)成熟標(biāo)記物RPE65,這表明3D-RPE-60D會(huì)在體內(nèi)由不成熟趨向成熟;(5)3D-RPE-60D細(xì)胞移植RCS變性大鼠視網(wǎng)膜下腔后4w、8w和12w ERG檢測(cè)中b波幅值都優(yōu)于PBS注射組和未處理組,4w時(shí)對(duì)感光細(xì)胞層的保護(hù)作用最強(qiáng),8w、12w有所下降,經(jīng)視網(wǎng)膜外核層厚度和ERG檢測(cè)發(fā)現(xiàn),3D-RPE-60D與2D-RPE-60D細(xì)胞相比,對(duì)RCS大鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用差異不顯著。結(jié)論1、人胚胎干細(xì)胞在三維誘導(dǎo)和二維誘導(dǎo)為RPE細(xì)胞過(guò)程中,色素灶形成、細(xì)胞傳代效率、RPE相關(guān)蛋白表達(dá)等生物學(xué)特性均相似,但3D-RPE細(xì)胞出現(xiàn)色素顆粒的時(shí)間較晚、PAX6表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng),而RPE65表達(dá)時(shí)間出現(xiàn)較晚,提示3D-RPE細(xì)胞較同時(shí)間段的2D-RPE更為年輕、幼稚,處于前體細(xì)胞階段。2、SCID免疫缺陷小鼠腹股溝畸胎瘤實(shí)驗(yàn)觀察,發(fā)現(xiàn)3D-RPE和2D-RPE均不成瘤。3、RPE細(xì)胞移植到RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔后,檢測(cè)視網(wǎng)膜感光外核層厚度和ERG電生理視功能,發(fā)現(xiàn)3D-RPE和2D-RPE對(duì)RCS大鼠變性視網(wǎng)膜的保護(hù)作用沒(méi)有明顯差異。
【關(guān)鍵詞】:hESC RPE細(xì)胞 二維誘導(dǎo)分化法 三維誘導(dǎo)分化法 視網(wǎng)膜色素變性 RCS大鼠 細(xì)胞移植
【學(xué)位授予單位】:第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2016
【分類號(hào)】:R774.1
【目錄】:
  • 縮略語(yǔ)表4-5
  • 英文摘要5-10
  • 中文摘要10-14
  • 第一章 前言14-18
  • 第二章 人胚胎干細(xì)胞經(jīng)兩種方法誘導(dǎo)為RPE細(xì)胞的生物學(xué)特性研究18-38
  • 2.1 二維分化法誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(2D-RPE)的研究18-24
  • 2.2 三維分化法誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(3D-RPE)的研究24-29
  • 2.3 二維和三維方法由h ESCs誘導(dǎo)得到的RPE細(xì)胞的生物學(xué)特性的比較研究29-38
  • 第三章 兩種方法誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的RPE細(xì)胞對(duì)RCS大鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用差異38-49
  • 3.1 人胚胎干細(xì)胞經(jīng)二維和三維方法誘導(dǎo)衍生的兩種RPE細(xì)胞移植治療RCS大鼠的安全性研究38-42
  • 3.2 人胚胎干細(xì)胞經(jīng)二維和三維方法誘導(dǎo)衍生的兩種RPE細(xì)胞移植治療RCS大鼠的有效性研究42-49
  • 全文結(jié)論49-50
  • 參考文獻(xiàn)50-53
  • 文獻(xiàn)綜述 人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞治療視網(wǎng)膜變性疾病的研究進(jìn)展53-64
  • 參考文獻(xiàn)60-64
  • 研究期間發(fā)表的文章64-65
  • 致謝65

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7 徐晨明;人胚胎干細(xì)胞建系及線粒體和細(xì)胞骨架的分布模式與胚胎干細(xì)胞分化關(guān)系的研究[D];浙江大學(xué);2008年

8 蘇位君;人胚胎干細(xì)胞來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞作為細(xì)胞載體對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌進(jìn)行靶向治療的研究[D];南開(kāi)大學(xué);2012年

9 方貞付;人胚胎干細(xì)胞和兔胚胎干細(xì)胞的建系與鑒定[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院(上海生命科學(xué)研究院);2005年

10 曾橋;人胚胎干細(xì)胞體內(nèi)分化途徑獲取神經(jīng)干細(xì)胞及DNA甲基化酶Dnmt3a和Dnmt3b表達(dá)下調(diào)對(duì)人胚胎干細(xì)胞的影響[D];中南大學(xué);2008年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 韋東;人胚胎干細(xì)胞相關(guān)發(fā)明可專利性研究[D];華東政法大學(xué);2011年

2 王丹;三氯乙烯抑制人胚胎干細(xì)胞向心肌分化的機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2015年

3 吳一湘;酪氨酸促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞向視網(wǎng)膜色素上皮高效分化的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2015年

4 馬永賓;人胚胎干細(xì)胞源間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的微囊泡對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)研究[D];江蘇大學(xué);2016年

5 李奇;人胚胎干細(xì)胞凍存體系的優(yōu)化及其向視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞的分化研究[D];吉林大學(xué);2016年

6 鄭良棟;人胚胎干細(xì)胞抗腫瘤作用的體外初步研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

7 呂林潔;人胚胎干細(xì)胞分化為可自我更新的神經(jīng)干細(xì)胞[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2016年

8 曾玉曉;二維和三維誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞來(lái)源RPE細(xì)胞的生物學(xué)特性比較研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2016年

9 韓兵;原始生殖細(xì)胞來(lái)源的人胚胎干細(xì)胞分離、培養(yǎng)與鑒定[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2004年

10 耿嘉tD;人胚胎干細(xì)胞建系相關(guān)影響因素研究[D];鄭州大學(xué);2007年



本文編號(hào):632167

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