本文關鍵詞：二維和三維誘導的人胚胎干細胞來源RPE細胞的生物學特性比較研究

  更多相關文章： hESC RPE細胞 二維誘導分化法 三維誘導分化法 視網(wǎng)膜色素變性 RCS大鼠 細胞移植

【摘要】：研究背景和目的視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)是由視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)細胞和視網(wǎng)膜光感受器細胞變性引起的遺傳性致盲眼病。目前,RP的治療尚沒有明確有效的方法。RPE細胞移植是目前治療RP最有遠大前景的治療方法。用于移植的RPE細胞大多來源于早期自體和同種異體RPE細胞及胚胎RPE細胞[1-5],存在細胞來源受限、RPE細胞活性差、免疫排斥反應及嚴重手術并發(fā)癥等諸多問題,限制了其臨床推廣。近年來多能干細胞來源的RPE細胞因其來源廣泛、生物學特性良好而漸漸成為RPE細胞移植的主要來源。2012年和2015年Schwartz等[6,7]兩次報告使用人胚胎干細胞(Human embryonic stem cells,hESCs)來源的RPE細胞(通過自發(fā)分化方法,本文以下統(tǒng)稱為二維誘導分化法)移植治療兩類視網(wǎng)膜變性疾病:年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)和Stargardt黃斑營養(yǎng)不良,均證實了hESCs來源的RPE細胞的安全性和有效性,這是hESCs來源的RPE細胞臨床移植的首次報道,揭開了人胚胎干細胞臨床轉化研究的序幕。胚胎干細胞分化為RPE細胞有多種方法,各方法誘導得到的RPE細胞的純度、活性、功能以及獲得的效率都有很大差別。近年來采用無血清培養(yǎng),可將小鼠或人胚胎干細胞誘導的擬胚體(Embryoid bodies,EBs)樣聚集體在特制的V字底培養(yǎng)皿結合基質(zhì)膠培養(yǎng)條件下快速再聚集,配合低濃度生長因子,可以有效地促進ESCs向類器官發(fā)育[8,9]。從這類胚胎干細胞來源的類器官中可以獲得包括RPE細胞在內(nèi)的各類治療細胞。由于這種全新的三維誘導分化法模擬了器官的體內(nèi)發(fā)育過程,從這種誘導方法得到的治療細胞被認為可能具有更好的生物學特性、更接近原代分離的治療細胞,但目前尚未見將hESCs經(jīng)傳統(tǒng)的二維誘導分化法和經(jīng)上述三維誘導分化法得到的RPE細胞(即2D-RPE和3D-RPE細胞)的生物學特性進行系統(tǒng)比較研究的相關報道。本研究擬首先建立hESCs的三維視泡視杯誘導方法,從中分離出RPE細胞,觀察RPE細胞的三維誘導分化過程并進行生物學鑒定,并與傳統(tǒng)的二維誘導分化法獲得的hESCs來源的RPE細胞在成熟度、細胞功能、移植后對變性視網(wǎng)膜的保護功能等方面進行比較,以明確三維誘導分化法獲得RPE細胞的特性,為臨床選擇合適的誘導方式提供依據(jù)。方法1、二維分化法誘導人胚胎干細胞為視網(wǎng)膜色素上皮細胞(2D-RPE細胞)(1)H1人胚胎干細胞的培養(yǎng)與鑒定;(2)2D-RPE細胞誘導過程中細胞的形態(tài)學變化研究;(3)2D-RPE細胞免疫熒光鑒定,通過分析Bestrophin、CRALBP、MITF和PAX6特異性標記物的表達,鑒定2D-RPE的成熟程度。2、三維法誘導人胚胎干細胞分化為視網(wǎng)膜色素上皮細胞(3D-RPE細胞)(1)3D-RPE細胞誘導過程中細胞的形態(tài)學變化研究;(2)3D-RPE細胞免疫熒光鑒定,通過研究Bestrophin、CRALBP、MITF和PAX6特異性標記物的表達,鑒定3D-RPE的成熟程度。3、比較3D-RPE和2D-RPE細胞的生物學特性(1)免疫熒光染色比較3D-RPE和2D-RPE細胞在誘導40d、60d和100d后細胞PAX6的表達差異,并比較PAX6陽性細胞率,以比較3D-RPE和2D-RPE中RPE前體細胞的陽性率差異。(2)通過免疫熒光染色和免疫印跡法,比較3D-RPE和2D-RPE細胞在誘導40d、60d和100d后成熟RPE細胞標記RPE65的表達情況,以明確兩種不同誘導方法中成熟RPE細胞的比例差異。4、觀察3D-RPE和2D-RPE細胞移植慢性視網(wǎng)膜色素變性大鼠模型(Royal college of surgeon,RCS)后的安全性和有效性(1)通過Ki67、mitochondrial和Dil共標記移植后4w的細胞,觀察細胞在體內(nèi)的增殖情況;將3D-RPE、2D-RPE細胞和hESC細胞分別移植SCID免疫缺陷小鼠腹股溝兩側皮下,每周觀察皮下情況至4個月,觀察畸胎瘤的形成情況。(2)通過RPE65、mitochondrial和Dil共標記移植RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔后4w的3D-RPE和2D-RPE細胞,觀察細胞在體內(nèi)的存活情況;同時采用Rhodopsin染色測量移植3D-RPE和2D-RPE細胞后4w、8w和12w RCS大鼠視網(wǎng)膜的外核層厚度、ERG電生理檢測b波幅值,以分析3D-RPE和2D-RPE細胞移植對變性視網(wǎng)膜保護作用的差異。結果H1的鑒定(1)hESCs傳代后第一天,細胞單個或多個生長,細長呈分支狀;第二天換去含Y-27632的培養(yǎng)液后,hESC細胞呈小克隆成團生長并逐漸增大,克隆團之間逐漸接觸融合;(2)培養(yǎng)的hESCs表達胚胎干細胞特異性標記物Nanog、SSEA-4、SOX2和OCT4,除SSEA-4表達在hESC細胞膜上外,其余胚胎干細胞標記物均表達在細胞核,陽性率均在99%以上。2、hESCs經(jīng)二維誘導和三維誘導分化為RPE細胞的過程和形態(tài)比較(1)hESCs通過二維誘導和三維誘導分化法向RPE細胞分化,誘導時間過程和所得的RPE細胞形態(tài)相似,20d在2D和3D培養(yǎng)誘導體系中都可以觀察到少量棕褐色的色素灶出現(xiàn)并逐漸增多增大,顏色由淺至深;挑出的RPE細胞在60d均呈典型的六角鵝卵石樣上皮細胞形態(tài),呈單層片狀,富含色素顆粒,細胞排列整齊且連接緊密;(2)3D-RPE和2D-RPE細胞誘導后60d均表達RPE特異性細胞標記物Bestrophin、CRALBP、MITF和PAX6,Bestrophin和CRALBP主要表達在RPE細胞膜上,少量細胞漿著色,整個RPE細胞出現(xiàn)較規(guī)則的網(wǎng)狀結構。MITF和PAX6定位于RPE細胞核,陽性率均在99%以上;在誘導后40d、60d和100d,3D-RPE中PAX6陽性細胞陽性率維持時間較2D-RPE更長,而RPE65在3D-RPE細胞中出現(xiàn)時間較2D-RPE細胞晚;提示3D-RPE較2D-RPE成熟更晚。(3)hESC經(jīng)三維分化法形成的視泡樣結構經(jīng)切片染色,可在該結構中發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層和色素上皮細胞的標記物PAX6、CRALBP,并在該結構的外層發(fā)現(xiàn)呈單層的視網(wǎng)膜色素上皮細胞,該結構內(nèi)層部分為多層視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮細胞,提示hESC經(jīng)三維分化可形成類似視杯的結構,該誘導過程類似視網(wǎng)膜發(fā)育過程;3、3D-RPE和2D-RPE細胞移植的安全性及對RCS大鼠視網(wǎng)膜的保護作用(1)3D-RPE和2D-RPE細胞皮下注入重度結合免疫缺陷(SCID)小鼠腹股溝兩側,隨訪4個月里未發(fā)現(xiàn)在皮下形成包塊,而陽性對照組的hESC細胞在注射后1個月在腹股溝出現(xiàn)明顯的皮下包塊,提示3D-RPE和2D-RPE無成瘤性。(2)3D-RPE和2D-RPE細胞移植到RSC變性大鼠視網(wǎng)膜下腔4w后,植入細胞可以形成單層,這些植入細胞人類線粒體和Dil細胞紅色標記共表達,提示移植細胞可以存活,未發(fā)現(xiàn)明顯的排斥反應;(3)植入的3D-RPE和2D-RPE細胞在4w時,Ki67均為陰性,提示移植細胞在體內(nèi)處于靜止期,并沒有繼續(xù)增殖;(4)體外實驗3D-RPE-60D細胞不表達RPE65,而2D-RPE-60D細胞RPE65呈陽性。3D-RPE-60D和2D-RPE-60D細胞移植到RSC變性大鼠視網(wǎng)膜下腔4w后均能共表達成熟標記物RPE65,這表明3D-RPE-60D會在體內(nèi)由不成熟趨向成熟;(5)3D-RPE-60D細胞移植RCS變性大鼠視網(wǎng)膜下腔后4w、8w和12w ERG檢測中b波幅值都優(yōu)于PBS注射組和未處理組,4w時對感光細胞層的保護作用最強,8w、12w有所下降,經(jīng)視網(wǎng)膜外核層厚度和ERG檢測發(fā)現(xiàn),3D-RPE-60D與2D-RPE-60D細胞相比,對RCS大鼠視網(wǎng)膜的保護作用差異不顯著。結論1、人胚胎干細胞在三維誘導和二維誘導為RPE細胞過程中,色素灶形成、細胞傳代效率、RPE相關蛋白表達等生物學特性均相似,但3D-RPE細胞出現(xiàn)色素顆粒的時間較晚、PAX6表達時間較長,而RPE65表達時間出現(xiàn)較晚,提示3D-RPE細胞較同時間段的2D-RPE更為年輕、幼稚,處于前體細胞階段。2、SCID免疫缺陷小鼠腹股溝畸胎瘤實驗觀察,發(fā)現(xiàn)3D-RPE和2D-RPE均不成瘤。3、RPE細胞移植到RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔后,檢測視網(wǎng)膜感光外核層厚度和ERG電生理視功能,發(fā)現(xiàn)3D-RPE和2D-RPE對RCS大鼠變性視網(wǎng)膜的保護作用沒有明顯差異。
【關鍵詞】：hESC RPE細胞 二維誘導分化法 三維誘導分化法 視網(wǎng)膜色素變性 RCS大鼠 細胞移植
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R774.1
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-10
• 中文摘要10-14
• 第一章 前言14-18
• 第二章 人胚胎干細胞經(jīng)兩種方法誘導為RPE細胞的生物學特性研究18-38
• 2.1 二維分化法誘導人胚胎干細胞為視網(wǎng)膜色素上皮細胞（2D-RPE）的研究18-24
• 2.2 三維分化法誘導人胚胎干細胞為視網(wǎng)膜色素上皮細胞（3D-RPE）的研究24-29
• 2.3 二維和三維方法由h ESCs誘導得到的RPE細胞的生物學特性的比較研究29-38
• 第三章 兩種方法誘導人胚胎干細胞來源的RPE細胞對RCS大鼠視網(wǎng)膜的保護作用差異38-49
• 3.1 人胚胎干細胞經(jīng)二維和三維方法誘導衍生的兩種RPE細胞移植治療RCS大鼠的安全性研究38-42
• 3.2 人胚胎干細胞經(jīng)二維和三維方法誘導衍生的兩種RPE細胞移植治療RCS大鼠的有效性研究42-49
• 全文結論49-50
• 參考文獻50-53
• 文獻綜述 人胚胎干細胞來源的視網(wǎng)膜色素上皮細胞治療視網(wǎng)膜變性疾病的研究進展53-64
• 參考文獻60-64
• 研究期間發(fā)表的文章64-65
• 致謝65

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