本文關鍵詞：中間纖維蛋白vimentin突變體E151K病理機制的分析

  更多相關文章： 細胞骨架 波形蛋白 晶體細胞α-TN4-1 蛋白質(zhì)SUMO化 E151K E151K/K313R/K373R

【摘要】：波形蛋白vimentin是脊椎動物進化過程中高度保守的一類III型中間纖維(IF)蛋白質(zhì),它與微管微絲共同構成細胞的骨架結構,對于支持和錨定細胞器的位置具有重要作用,參與構成細胞銜接和調(diào)節(jié)細胞粘附及細胞遷移。遺傳性白內(nèi)障是眼睛致盲的重要原因之一,造成遺傳性白內(nèi)障突變的基因包括編碼晶狀體結構蛋白,轉(zhuǎn)錄因子,膜蛋白和離子通道蛋白等一系列基因。已有研究表明,細胞骨架中間纖維蛋白vimentin編碼基因中的G596A點突變產(chǎn)生E151K的無義突變蛋白質(zhì)并導致白內(nèi)障。究其機理,此突變導致vimentin骨架蛋白組裝紊亂,細胞骨架結構改變,從而引發(fā)白內(nèi)障,但是這一突變?yōu)楹文軐е聉imentin蛋白組裝紊亂目前尚不清楚。SUMO是類泛素小分子蛋白,它在一系列連接酶的作用下,結合到其它蛋白質(zhì)上,稱為蛋白質(zhì)SUMO化,是一種翻譯后重要的修飾方式,能調(diào)節(jié)一系列的細胞生理過程,包括蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用,亞細胞器定位,蛋白質(zhì)與DNA作用以及酶活性調(diào)節(jié)。本實驗室對SUMO化調(diào)節(jié)眼睛發(fā)育,特別是晶狀體的發(fā)育有深入的研究,我們的工作證實在眼睛發(fā)育過程中,P32kd PAX6能夠被SUMO化,從而激活其DNA結合能力,調(diào)控下游基因表達。同時我們還發(fā)現(xiàn)SUMO1介導的SUMO化能增強SP1的調(diào)節(jié)功能從而正向調(diào)節(jié)細胞分化,而SUMO2/3則通過SP1轉(zhuǎn)錄因子的SUMO化而抑制細胞的分化。鑒于vimentin E151K突變產(chǎn)生一個十分保守的SUMO化位點,我們推測vimentin E151K突變引起的白內(nèi)障是由于在E151K位點產(chǎn)生了SUMO化而抑制它的聚合,從而阻礙細胞骨架的正常結構和功能。我們小組周璐的工作主要是成功構建了pCI-neo-vimentin表達載體和p CI-neo-E151K-vimentin表達載體,并且建立了野生型和E151K突變型轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定細胞系。在此工作基礎之上,由于野生型vimentin中存在潛在的兩個SUMO化位點,K313和K373,由此我成功構建了pCI-neo-K313R-vimentin表達載體,pCI-neo-K373R-vimentin表達載體,pCI-neo-K313R/K373R-vimentin雙突變表達載體,pCI-neo-K313R/K373R/E151K-vimentin三突變表達載體。通過使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑作為介導分子,把雙突變型、三突變型vimentin表達載體轉(zhuǎn)入晶狀體上皮細胞α-TN4-1系,在G418藥物篩選下,成功獲得了表達雙突變型,三突變型轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定細胞株。通過使用西方雜交和免疫熒光技術,對穩(wěn)定克隆進行了鑒定,并挑出了表達相當?shù)目寺∮糜谶M一步實驗。對比野生型和突變型,雙突變型和三突變型轉(zhuǎn)化的細胞株vimentin的表達水平,SUMO化狀態(tài)和細胞形態(tài)結果,初步推斷E151K被SUMO化,造成其聚合受阻,因此導致白內(nèi)障發(fā)生。我們的工作首次闡明了vimentin E151K突變造成白內(nèi)障的分子機制。
【關鍵詞】：細胞骨架 波形蛋白 晶體細胞α-TN4-1 蛋白質(zhì)SUMO化 E151K E151K/K313R/K373R
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R776.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 1 前言11-22
• 1.1 中間纖維 (Intermediate Filaments)11
• 1.2 波形蛋白vimentin11-16
• 1.2.1 vimentin的結構11-13
• 1.2.2 vimentin的去組裝13-14
• 1.2.3 vimentin的功能與疾病14-16
• 1.3 類泛素化蛋白SUMO16-21
• 1.3.1 SUMO化酶促過程17-19
• 1.3.2 SUMO化的去除19-20
• 1.3.3 SUMO化的功能20-21
• 1.3.4 SUMO與泛素化蛋白酶體相互作用21
• 1.4 本課題研究背景21-22
• 2 實驗材料和方法22-37
• 2.1 實驗材料與試劑22-23
• 2.1.1 材料與試劑22
• 2.1.2 儀器設備22-23
• 2.2 實驗方法23-37
• 2.2.1 小鼠vimentin cDNA的克隆23-26
• 2.2.2 pCI-neo-K313R-vimentin，，p CI-neo-K373R-vimentin表達載體的構建26-31
• 2.2.3 p CI-neo-K313R/K373R-vimentin表達載體的構建31-32
• 2.2.4 p CI-neo-K313R/K373R/E151K-vimentin表達載體的構建32
• 2.2.5 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染α-TN4-1 細胞系32-35
• 2.2.6 免疫熒光爬片技術35-37
• 3 實驗結果和討論37-43
• 3.1 實驗結果37-42
• 3.1.1 pCI-neo-K313R-vimentin，p CI-neo-K373R-vimentin表達載體的鑒定37-38
• 3.1.2 p CI-neo-K313R/K373R-vimentin表達載體的鑒定38-39
• 3.1.3 p CI-neo-K313R/K373R/E151K-vimentin表達載體的鑒定39-40
• 3.1.4 轉(zhuǎn)染野生型和E151K型細胞的免疫熒光結果40-41
• 3.1.5 轉(zhuǎn)染雙突變型和三突變型細胞的免疫熒光結果41-42
• 3.2 討論與展望42-43
• 參考文獻43-51
• 碩士期間發(fā)表的論文情況51-52
• 致謝52-53

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4 王

本文編號：613977