本文關(guān)鍵詞：中間纖維蛋白vimentin突變體E151K病理機(jī)制的分析

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【摘要】：波形蛋白vimentin是脊椎動(dòng)物進(jìn)化過程中高度保守的一類III型中間纖維(IF)蛋白質(zhì),它與微管微絲共同構(gòu)成細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu),對于支持和錨定細(xì)胞器的位置具有重要作用,參與構(gòu)成細(xì)胞銜接和調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附及細(xì)胞遷移。遺傳性白內(nèi)障是眼睛致盲的重要原因之一,造成遺傳性白內(nèi)障突變的基因包括編碼晶狀體結(jié)構(gòu)蛋白,轉(zhuǎn)錄因子,膜蛋白和離子通道蛋白等一系列基因。已有研究表明,細(xì)胞骨架中間纖維蛋白vimentin編碼基因中的G596A點(diǎn)突變產(chǎn)生E151K的無義突變蛋白質(zhì)并導(dǎo)致白內(nèi)障。究其機(jī)理,此突變導(dǎo)致vimentin骨架蛋白組裝紊亂,細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變,從而引發(fā)白內(nèi)障,但是這一突變?yōu)楹文軐?dǎo)致vimentin蛋白組裝紊亂目前尚不清楚。SUMO是類泛素小分子蛋白,它在一系列連接酶的作用下,結(jié)合到其它蛋白質(zhì)上,稱為蛋白質(zhì)SUMO化,是一種翻譯后重要的修飾方式,能調(diào)節(jié)一系列的細(xì)胞生理過程,包括蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用,亞細(xì)胞器定位,蛋白質(zhì)與DNA作用以及酶活性調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)室對SUMO化調(diào)節(jié)眼睛發(fā)育,特別是晶狀體的發(fā)育有深入的研究,我們的工作證實(shí)在眼睛發(fā)育過程中,P32kd PAX6能夠被SUMO化,從而激活其DNA結(jié)合能力,調(diào)控下游基因表達(dá)。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)SUMO1介導(dǎo)的SUMO化能增強(qiáng)SP1的調(diào)節(jié)功能從而正向調(diào)節(jié)細(xì)胞分化,而SUMO2/3則通過SP1轉(zhuǎn)錄因子的SUMO化而抑制細(xì)胞的分化。鑒于vimentin E151K突變產(chǎn)生一個(gè)十分保守的SUMO化位點(diǎn),我們推測vimentin E151K突變引起的白內(nèi)障是由于在E151K位點(diǎn)產(chǎn)生了SUMO化而抑制它的聚合,從而阻礙細(xì)胞骨架的正常結(jié)構(gòu)和功能。我們小組周璐的工作主要是成功構(gòu)建了pCI-neo-vimentin表達(dá)載體和p CI-neo-E151K-vimentin表達(dá)載體,并且建立了野生型和E151K突變型轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定細(xì)胞系。在此工作基礎(chǔ)之上,由于野生型vimentin中存在潛在的兩個(gè)SUMO化位點(diǎn),K313和K373,由此我成功構(gòu)建了pCI-neo-K313R-vimentin表達(dá)載體,pCI-neo-K373R-vimentin表達(dá)載體,pCI-neo-K313R/K373R-vimentin雙突變表達(dá)載體,pCI-neo-K313R/K373R/E151K-vimentin三突變表達(dá)載體。通過使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑作為介導(dǎo)分子,把雙突變型、三突變型vimentin表達(dá)載體轉(zhuǎn)入晶狀體上皮細(xì)胞α-TN4-1系,在G418藥物篩選下,成功獲得了表達(dá)雙突變型,三突變型轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定細(xì)胞株。通過使用西方雜交和免疫熒光技術(shù),對穩(wěn)定克隆進(jìn)行了鑒定,并挑出了表達(dá)相當(dāng)?shù)目寺∮糜谶M(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。對比野生型和突變型,雙突變型和三突變型轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株vimentin的表達(dá)水平,SUMO化狀態(tài)和細(xì)胞形態(tài)結(jié)果,初步推斷E151K被SUMO化,造成其聚合受阻,因此導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生。我們的工作首次闡明了vimentin E151K突變造成白內(nèi)障的分子機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)胞骨架 波形蛋白 晶體細(xì)胞α-TN4-1 蛋白質(zhì)SUMO化 E151K E151K/K313R/K373R
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R776.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 1 前言11-22
• 1.1 中間纖維 (Intermediate Filaments)11
• 1.2 波形蛋白vimentin11-16
• 1.2.1 vimentin的結(jié)構(gòu)11-13
• 1.2.2 vimentin的去組裝13-14
• 1.2.3 vimentin的功能與疾病14-16
• 1.3 類泛素化蛋白SUMO16-21
• 1.3.1 SUMO化酶促過程17-19
• 1.3.2 SUMO化的去除19-20
• 1.3.3 SUMO化的功能20-21
• 1.3.4 SUMO與泛素化蛋白酶體相互作用21
• 1.4 本課題研究背景21-22
• 2 實(shí)驗(yàn)材料和方法22-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑22-23
• 2.1.1 材料與試劑22
• 2.1.2 儀器設(shè)備22-23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-37
• 2.2.1 小鼠vimentin cDNA的克隆23-26
• 2.2.2 pCI-neo-K313R-vimentin，，p CI-neo-K373R-vimentin表達(dá)載體的構(gòu)建26-31
• 2.2.3 p CI-neo-K313R/K373R-vimentin表達(dá)載體的構(gòu)建31-32
• 2.2.4 p CI-neo-K313R/K373R/E151K-vimentin表達(dá)載體的構(gòu)建32
• 2.2.5 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染α-TN4-1 細(xì)胞系32-35
• 2.2.6 免疫熒光爬片技術(shù)35-37
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論37-43
• 3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-42
• 3.1.1 pCI-neo-K313R-vimentin，p CI-neo-K373R-vimentin表達(dá)載體的鑒定37-38
• 3.1.2 p CI-neo-K313R/K373R-vimentin表達(dá)載體的鑒定38-39
• 3.1.3 p CI-neo-K313R/K373R/E151K-vimentin表達(dá)載體的鑒定39-40
• 3.1.4 轉(zhuǎn)染野生型和E151K型細(xì)胞的免疫熒光結(jié)果40-41
• 3.1.5 轉(zhuǎn)染雙突變型和三突變型細(xì)胞的免疫熒光結(jié)果41-42
• 3.2 討論與展望42-43
• 參考文獻(xiàn)43-51
• 碩士期間發(fā)表的論文情況51-52
• 致謝52-53

【相似文獻(xiàn)】

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4 王

本文編號：613977