本文關(guān)鍵詞：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞株的建立及過表達(dá)抗凋亡基因Bcl-2的iPSCs構(gòu)建

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【摘要】：研究背景感音神經(jīng)性耳聾主要是由毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)的衰亡所致,哺乳動物的耳蝸細(xì)胞在出生后喪失再生修復(fù)能力,在受到耳毒性藥物、感染、噪音等嚴(yán)重創(chuàng)傷后,內(nèi)耳細(xì)胞可能發(fā)生變性,甚至壞死、凋亡,聽力將不可逆性下降。干細(xì)胞耳蝸植入作為內(nèi)耳疾病的一種治療手段,有望實(shí)現(xiàn)毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)的再生修復(fù),從而重建聽力。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs),是將體細(xì)胞重編程為類似胚胎干細(xì)胞的一類具有多能性的干細(xì)胞,可以作為細(xì)胞治療的供體,并已在多個領(lǐng)域產(chǎn)生極好的效果。然而內(nèi)耳移植環(huán)境的損傷狀態(tài)、干細(xì)胞移植存活率低下一直是內(nèi)耳再生修復(fù)領(lǐng)域的兩大困擾,是否可以通過以干細(xì)胞治療為基礎(chǔ),結(jié)合基因干預(yù)的手段,同時解決上述兩個問題�；谝陨锨闆r,我們展開了如下研究。目的構(gòu)建尿液來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞,為內(nèi)耳疾病的治療提供候選細(xì)胞；構(gòu)建過表達(dá)抗凋亡基因Bcl-2的iPSCs,為實(shí)現(xiàn)內(nèi)耳疾病細(xì)胞、基因聯(lián)合治療模式的探究提供前期準(zhǔn)備。方法獲取來自正常人的尿液樣本,通過經(jīng)典的四因子0ct4, Sox2, c-myc和Klf4途徑誘導(dǎo)多能干細(xì)胞并完成其多能性驗(yàn)證；通過構(gòu)建攜帶Bcl-2抗凋亡基因的慢病毒,感染iPSCs,驗(yàn)證過表達(dá)Bcl-2對其生存、分化及全能性的影響,并測定過表達(dá)Bcl-2的iPSCs誘導(dǎo)的神經(jīng)元的神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌水平。結(jié)果1.完成了尿液來源的正常人iPSCs的構(gòu)建1.1分離、獲得正常人的尿液來源的上皮細(xì)胞系,細(xì)胞呈纖維樣、上皮樣,且分裂增殖速度快,狀態(tài)良好。1.2四因子誘導(dǎo)的iPSCs細(xì)胞株建立,克隆呈類圓形,邊界清晰、銳利,克隆內(nèi)細(xì)胞均一、核大、排列致密,且核質(zhì)比高。1.3堿性磷酸酶活性呈強(qiáng)陽性；SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、0CT4、NANOG等抗原呈陽性表達(dá)；內(nèi)源性ES標(biāo)志性基因0CT4、S0X2、KLF4、NANOG能激活并表達(dá)；外源性基因0ct4, Sox2, c-myc和Klf4均整合入iPSCs基因組,但均未被表達(dá)激活；擬胚體、畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)均鑒定陽性。檢測證實(shí)構(gòu)建的iPSCs具有全能性,且無致癌基因c-Myc的表達(dá)。2.成功構(gòu)建了過表達(dá)Bcl-2抗凋亡基因的iPSCs2.1構(gòu)建攜帶Bcl-2的重組慢病毒。2.2構(gòu)建過表達(dá)Bcl-2的iPSCs,并驗(yàn)證其存活,擬胚體形成、神經(jīng)元的分化能力均不受影響。2.3過表達(dá)Bcl-2的iPSCs誘導(dǎo)的神經(jīng)元,BDNF、NT3水平顯著提高,而NGF的表達(dá)水平無明顯改變。結(jié)論1.人的尿液中可以獲得分裂、增殖能力良好的上皮細(xì)胞。2.經(jīng)尿液來源的上皮細(xì)胞誘導(dǎo)的iPSCs細(xì)胞株具有分化全能性。3.Bcl-2基因可以通過重組慢病毒構(gòu)建,且能感染iPSCs細(xì)胞。4.過表達(dá)Bcl-2抗凋亡基因的iPSCs,其存活、分化、多能性無明顯差異。5.過表達(dá)Bcl-2的iPSCs誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞,BDNF、NT3等神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌水平提高,NGF無明顯差異。
【關(guān)鍵詞】：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 Bcl-2家族蛋白 感音神經(jīng)性耳聾 細(xì)胞治療 基因治療
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R764.43
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 本課題中使用到的主要儀器11-12
• 主要試劑的配制12-14
• 英文縮寫注釋14-16
• 1 前言16-20
• 2 材料與方法20-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20
• 2.2 標(biāo)本收集20-21
• 2.3 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞株建立、鑒定21-27
• 2.4 過表達(dá)Bcl-2的iPSCs構(gòu)建27-31
• 3 結(jié)果31-39
• 4 討論39-43
• 5 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-50
• 綜述50-61
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 個人簡歷61

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2 王英杰;劉濤;張世昌;;誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2009年09期

3 張雷鳴;張劍寧;;誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2009年05期

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5 楊夢晗;化冰;池亞菲;王超;;誘導(dǎo)多能干細(xì)胞研究進(jìn)展[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2012年01期

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本文編號：537377