本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導(dǎo)的C-jun基因沉默對(duì)放射抗拒人鼻咽癌胞系CNE-2R放射敏感性的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[研究背景]鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一種好發(fā)于東南亞地區(qū)及我國(guó)南方各省的常見惡性腫瘤。鼻咽癌患者放療后局部的復(fù)發(fā)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是制約其療效和預(yù)后的瓶頸,放射抗拒是制約鼻咽癌患者5年生存率的關(guān)鍵因素。有研究表明,輻射誘導(dǎo)的基因調(diào)控和表達(dá)的差異可能與放射抗拒的發(fā)生有關(guān)。因此,尋找能夠早期預(yù)測(cè)鼻咽癌輻射敏感性的分子標(biāo)志物對(duì)于個(gè)體化放射治療具有重要意義。本課題組將前期篩選出與放射抗拒相關(guān)的分子標(biāo)志物進(jìn)行基因本體論(gene ontology)、通路分析(Pathway analysis)及蛋白質(zhì)互做網(wǎng)絡(luò)技術(shù)(Protein interaction network)進(jìn)行綜合分析,從放射抗拒相關(guān)基因或蛋白質(zhì)互做網(wǎng)絡(luò)中獲取多個(gè)與輻射抗拒相關(guān)的關(guān)鍵性標(biāo)志物。我們選取在通路構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)上的節(jié)點(diǎn)之一的c-jun作為候選基因,為明確c-jun基因與鼻咽癌放射抗拒之間的相關(guān)性,我們利用對(duì)RNA干擾技術(shù)抑制放射抗拒人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2R中高表達(dá)的c-jun基因,探究其對(duì)CNE-2R細(xì)胞放射敏感性的影響及其潛在機(jī)制。初步探討c-jun基因能否成為鼻咽癌分子治療的新靶點(diǎn)。研究?jī)?nèi)容第一部分慢病毒shRNA載體構(gòu)建并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CNE-2R細(xì)胞株[目的]本課題組前期發(fā)現(xiàn)c-jun基因在放射抗拒細(xì)胞株CNE-2R中呈高表達(dá),因其涉及多條通路且是基因互作網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)之一,為明確c-jun基因與鼻咽癌放射抗拒之間的相關(guān)性,我們利用RNAi抑制放射抗拒人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2R中高表達(dá)的c-jun基因,并篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株,為探究其對(duì)CNE-2R細(xì)胞放射敏感性的影響奠定基礎(chǔ)。[方法]1.采用RT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)分別在mRNA及蛋白水平上驗(yàn)證c-jun基因的表達(dá)。2.設(shè)計(jì)合成3組特異性針對(duì)c-jun基因的siRNA,構(gòu)建慢病毒shRNA載體,感染CNE-2R細(xì)胞。3.將感染目的細(xì)胞CNE-2R,經(jīng)流式分選獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株,采用RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組對(duì)目的基因的抑制效果,篩選出沉默效果最佳的靶點(diǎn)。[結(jié)果]1. RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)c-jun基因的表達(dá)情況與芯片結(jié)果相符。2.經(jīng)測(cè)序證實(shí),3組特異性針對(duì)c-jun基因的siRNA,成功構(gòu)建慢病毒shRNA載體,并包裝出滴度為8×108TU/ml。感染CNE-2R細(xì)胞,熒光倒置顯微鏡下觀察,顯示各組感染效率均在80%以上,感染成功。3. RT-PCR和Western blot篩選出最佳干擾靶點(diǎn),siRNA序列為：CAAACCTCAGCAACTTCAA。[結(jié)論]RNA干擾技術(shù)可有效抑制放射抗拒人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2R中高表達(dá)的c-jun基因,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。第二部分慢病毒-介導(dǎo)的C-jun基因沉默對(duì)放射抗拒人鼻咽癌CNE-2R細(xì)胞生物學(xué)行為及放射敏感性的影響[目的]利用RNA干擾技術(shù)抑制放射抗拒人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2R中高表達(dá)的c-jun基因,觀察c-jun基因沉默后對(duì)CNE-2R細(xì)胞的存活能力、周期、凋亡及放射敏感性的影響,了解c-jun基因與鼻咽癌放射敏感性間的相關(guān)性。[方法]1.CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)感染前后細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,分析c-jun基因沉默前后對(duì)CNE.2R細(xì)胞生存率的影響。2.克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定c-jun基因沉默前后,CNE-2R細(xì)胞放射敏感性的變化。3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)0 Gy和2 Gy處理后各組細(xì)胞周期及凋亡率的變化,分析c-jun基因沉默后對(duì)CNE-2R細(xì)胞周期及凋亡的影響。[結(jié)果]1.CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：6MV X射線聯(lián)合c-jun基因沉默組在0、2、4、6和8 Gy照射后細(xì)胞的吸光度OD值均顯著低于未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組(F=42.70～200.67,P0.05)。2.克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示,c-jun基因沉默組與未轉(zhuǎn)染組及陰性對(duì)照組相比,SF2、D0和Dq值均減小,放射增敏比(SERD0)為1.41。3.細(xì)胞周期結(jié)果顯示：0Gy：未轉(zhuǎn)染組、NC組和c-jun-RNAi-LV2實(shí)驗(yàn)組G2/M所占比例分別為18.27±5.28,17.13±3.35,27.33±1.58,c-jun基因沉默組與另兩組相比G2/M所占比例增加(P0.05)；2Gy：三組G2/M所占比例分別為19.93+4.99,17.634±3.01,28.57±2.9(P0.05)。4.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,未經(jīng)照射的c-jun基因沉默組與聯(lián)合2 Gy照射的凋亡率分別為(20.93+1.99)%和(38.17±0.83)%,均高于未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組的凋亡率[0 Gy;(10.97±0.70)%和(10.80±1.25)%；2 Gy：(20.43±0.25)%和(19.53+1.50)%；F=50.54、330.14,P0.05]。[結(jié)論]c-jun基因可能通過(guò)抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)凋亡,從而增強(qiáng)CNE-2R細(xì)胞的放射敏感性,提示c-jun可能成為提高鼻咽癌放射敏感性的潛在靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌 c-jun基因 RNA干擾 慢病毒載體 鼻咽癌 c-jun基因 RNA干擾 放射敏感性
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.63
【目錄】：

• 個(gè)人簡(jiǎn)歷3-5
• 摘要5-10
• ABSTRACT10-17
• 前言17-19
• 第一部分 慢病毒shRNA載體構(gòu)建并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CNE-2R細(xì)胞株19-42
• 引言19-20
• 1.1 材料20-24
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法24-34
• 1.3 結(jié)果34-40
• 1.4 討論40-42
• 第二部分 慢病毒介導(dǎo)的c-jun基因沉默對(duì)放射抗拒人鼻咽癌CNE-2R細(xì)胞生物學(xué)行為及放射敏感性的影響42-56
• 引言42
• 2.1 材料42-43
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法43-48
• 2.3 結(jié)果48-53
• 2.4 討論53-56
• 附錄56-58
• 綜述58-64
• 參考文獻(xiàn)64-72
• 致謝72-74
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文74-75
• 附件75-80

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

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  本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導(dǎo)的C-jun基因沉默對(duì)放射抗拒人鼻咽癌胞系CNE-2R放射敏感性的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：438626