本文關(guān)鍵詞：miR-17-5p在低氧環(huán)境下影響頦舌肌肌衛(wèi)星細胞線粒體功能的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征發(fā)生的根本原因在于睡眠期間發(fā)生反復(fù),部分或完全的上氣道阻塞。上氣道阻塞與否主要取決于兩大因素:解剖結(jié)構(gòu)和上氣道擴張肌張力。頦舌肌是最重要的上氣道擴張肌之一,其功能異�？梢詫е律蠚獾赖南蓍],甚至呼吸暫停。維持頦舌肌功能正常的基礎(chǔ)是其線粒體能量代謝的平衡。有研究顯示,OSAHS患者由于肌纖維類型發(fā)生變化,維持頦舌肌張力的產(chǎn)能方式向能量代謝效率較低的糖酵解型轉(zhuǎn)變,其副產(chǎn)物乳酸的增加使肌肉組織更易疲勞,加重了上氣道阻塞的程度。然而,這一線粒體能量代謝過程對低氧環(huán)境的適應(yīng)非常復(fù)雜,其具體機制尚不清楚。有研究者發(fā)現(xiàn),mi RNAs可以從轉(zhuǎn)錄后水平精確的調(diào)控線粒體功能,低氧調(diào)控mi RNAs的出現(xiàn)使研究者們開始注意到這些發(fā)生改變的mi RNAs可以在低氧環(huán)境下調(diào)控細胞能量代謝水平,從而可能實現(xiàn)對線粒體功能的恢復(fù)甚至增強。因此,本研究結(jié)合課題組前期研究結(jié)果及國內(nèi)外文獻,擬探討mi R-17-5p與頦舌肌及線粒體功能之間的關(guān)系,從而達到揭示miRNAs治療能量代謝異常所致的肌肉功能減退性疾病的分子生物學機制,為OSAHS的臨床治療提供更多的理論依據(jù)。方法1.應(yīng)用改良間歇性低壓氧裝置建立SD大鼠低氧動物模型,通過腹主動脈血血氣分析進行模型評定。2.通過he染色、atp酶組織化學染色及透射電鏡觀察的方法檢測低氧對頦舌肌能量代謝能力的影響。3.應(yīng)用酶消化的方法分離培養(yǎng)大鼠頦舌肌肌衛(wèi)星細胞(genioglossusmusclesatellitecells,ggmuscs);采用差速貼壁技術(shù)進行細胞純化;通過免疫熒光染色技術(shù)鑒定細胞純度。4.通過rt-pcr反應(yīng)比較低氧與常氧動物模型mir-17家族表達量變化,篩選目標mir-17;通過在不同低氧時間下檢測mir-17-5p相對表達量,進行mir-17-5p作用敏感時間的篩選。5.應(yīng)用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)、下調(diào)mir-17-5p,進行實驗分組;通過mtt比色法、流式細胞術(shù)檢測各組ggmuscs增殖及凋亡。6.通過以下三個方面檢測上調(diào)、下調(diào)mir-17-5p后對ggmuscs線粒體功能的影響:采用透射電鏡觀察細胞線粒體超微結(jié)構(gòu);應(yīng)用線粒體膜電位熒光探針檢測各組跨膜電位不同;通過激光共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察各組ca2+轉(zhuǎn)運變化。7.通過生物信息學分析軟件預(yù)測mir-17-5p與線粒體功能相關(guān)的靶基因;通過rt-pcr及westernblot檢測靶基因mrna及蛋白水平變化,進行靶基因的初步確定。結(jié)果1.間歇性低氧模型建立成功,血氣分析結(jié)果顯示低氧模型組sd大鼠血氧飽和度及氧分壓較對照組顯著降低(p0.05)。2.he染色、atp酶組織化學染色顯示:低氧組大鼠頦舌�、蛐图±w維較對照組增多,提示其能量代謝方式向產(chǎn)能效率低的糖酵解型轉(zhuǎn)變;經(jīng)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn):低氧組大鼠頦舌肌肌纖維間線粒體數(shù)量減少,線粒體水腫,嵴斷裂;以上結(jié)果均提示低氧組大鼠頦舌肌線粒體能量代謝功能受到損傷。3.倒置顯微鏡下觀察到ggmuscs分化成肌管后呈現(xiàn)節(jié)律性收縮;細胞免疫熒光染色結(jié)果顯示骨骼肌特異性肌球蛋白染色呈陽性,陽染細胞比例大于95%,表明所培養(yǎng)的ggmuscs純度高,可以應(yīng)用于后續(xù)的實驗。4.通過rt-pcr檢測mir-17家族在低氧模型組中表達量,確定mir-17-5p為本實驗研究目標;比較不同低氧時間mir-17-5p表達量變化,確定低氧12h為mir-17-5p作用敏感時間。5.MTT、流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:低氧組與常氧組相比,細胞活性下降,凋亡率升高,表明低氧造成了細胞損傷;在轉(zhuǎn)染anti-miR-17-5p的低氧組細胞,其細胞活性較低氧組降低,凋亡率較低氧組上升,表明抑制miR-17-5p對細胞產(chǎn)生了一定的損害;在轉(zhuǎn)染pre-miR-17-5p的低氧組細胞,其細胞活性有所恢復(fù),凋亡率較低氧組下降,表明上調(diào)miR-17-5p對細胞有一定的保護作用。6.通過研究各組細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)、膜電位水平及Ca2+轉(zhuǎn)運這三個與線粒體功能密切相關(guān)的指標,本實驗發(fā)現(xiàn)低氧組線粒體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)線粒體嵴斷裂等明顯損傷,線粒體功能受損,其膜電位勢能較低,Ca2+滯留;在轉(zhuǎn)染anti-miR-17-5p的低氧組細胞,其超微結(jié)構(gòu)損傷與低氧組無異,但溶酶體吞噬線粒體現(xiàn)象增多,線粒體膜電位勢能降低,初始鈣滯留濃度較低氧組有所上升,表明抑制miR-17-5p對線粒體功能產(chǎn)生了傷害;在轉(zhuǎn)染pre-miR-17-5p的低氧組細胞,其超微結(jié)構(gòu)損傷程度減輕,線粒體膜電位勢能有所恢復(fù),初始鈣滯留濃度下降,表明上調(diào)miR-17-5p對線粒體有一定的保護作用。7.通過生物信息學分析、RT-PCR及Western Blot檢測發(fā)現(xiàn),線粒體融合蛋白2(Mfn2)基因與蛋白水平變化與miR-17-5p的變化趨勢相反,提示Mfn2可能是mi R-17-5p作用于線粒體功能的靶基因。結(jié)論1.通過改良間歇性低壓低氧裝置可以有效的建立OSAHS低氧動物模型。2.低氧能夠造成頦舌肌線粒體病理性水腫,肌纖維結(jié)構(gòu)受損,頦舌肌能量代謝方式改變。3.應(yīng)用酶消化+差速貼壁技術(shù)可以有效獲得頦舌肌肌衛(wèi)星細胞。4.上調(diào)miR-17-5p對頦舌肌肌衛(wèi)星細胞線粒體功能有一定的保護作用。5.Mfn2可能是miR-17-5p作用于線粒體功能的靶基因。
【關(guān)鍵詞】：阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征 間歇性低氧動物模型 頦舌肌 mi R-17-5p 線粒體
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R766
【目錄】：

• 縮略語表3-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-14
• 文獻回顧14-29
• 第一部分 阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征14-20
• 第二部分 低氧與 OSAHS 的聯(lián)系20-22
• 第三部分 頦舌肌與 OSAHS 的聯(lián)系22-26
• 第四部分 低氧 mi RNAs 與頦舌肌能量代謝26-29
• 第一部分 低氧影響頦舌肌功能的動物實驗29-39
• 1 材料29-30
• 2 方法30-33
• 3 結(jié)果33-37
• 4 討論37-39
• 第二部分 大鼠頦舌肌肌衛(wèi)星細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及低氧mi R175p的確定39-51
• 1 材料39-40
• 2 方法40-45
• 3 結(jié)果45-49
• 4 討論49-51
• 第三部分mi R175p對頦舌肌肌衛(wèi)星細胞線粒體功能的影響及其靶基因的初步探索51-66
• 1 材料51-52
• 2 方法52-56
• 3 結(jié)果56-63
• 4 討論63-66
• 全文總結(jié)66-67
• 參考文獻67-74
• 研究成果74

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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10 李勤;李，

本文編號：409469