本文關(guān)鍵詞：miR-17-5p在低氧環(huán)境下影響頦舌肌肌衛(wèi)星細(xì)胞線粒體功能的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征發(fā)生的根本原因在于睡眠期間發(fā)生反復(fù),部分或完全的上氣道阻塞。上氣道阻塞與否主要取決于兩大因素:解剖結(jié)構(gòu)和上氣道擴(kuò)張肌張力。頦舌肌是最重要的上氣道擴(kuò)張肌之一,其功能異�？梢詫�(dǎo)致上氣道的陷閉,甚至呼吸暫停。維持頦舌肌功能正常的基礎(chǔ)是其線粒體能量代謝的平衡。有研究顯示,OSAHS患者由于肌纖維類型發(fā)生變化,維持頦舌肌張力的產(chǎn)能方式向能量代謝效率較低的糖酵解型轉(zhuǎn)變,其副產(chǎn)物乳酸的增加使肌肉組織更易疲勞,加重了上氣道阻塞的程度。然而,這一線粒體能量代謝過程對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)非常復(fù)雜,其具體機(jī)制尚不清楚。有研究者發(fā)現(xiàn),mi RNAs可以從轉(zhuǎn)錄后水平精確的調(diào)控線粒體功能,低氧調(diào)控mi RNAs的出現(xiàn)使研究者們開始注意到這些發(fā)生改變的mi RNAs可以在低氧環(huán)境下調(diào)控細(xì)胞能量代謝水平,從而可能實(shí)現(xiàn)對(duì)線粒體功能的恢復(fù)甚至增強(qiáng)。因此,本研究結(jié)合課題組前期研究結(jié)果及國內(nèi)外文獻(xiàn),擬探討mi R-17-5p與頦舌肌及線粒體功能之間的關(guān)系,從而達(dá)到揭示miRNAs治療能量代謝異常所致的肌肉功能減退性疾病的分子生物學(xué)機(jī)制,為OSAHS的臨床治療提供更多的理論依據(jù)。方法1.應(yīng)用改良間歇性低壓氧裝置建立SD大鼠低氧動(dòng)物模型,通過腹主動(dòng)脈血血?dú)夥治鲞M(jìn)行模型評(píng)定。2.通過he染色、atp酶組織化學(xué)染色及透射電鏡觀察的方法檢測(cè)低氧對(duì)頦舌肌能量代謝能力的影響。3.應(yīng)用酶消化的方法分離培養(yǎng)大鼠頦舌肌肌衛(wèi)星細(xì)胞(genioglossusmusclesatellitecells,ggmuscs);采用差速貼壁技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞純化;通過免疫熒光染色技術(shù)鑒定細(xì)胞純度。4.通過rt-pcr反應(yīng)比較低氧與常氧動(dòng)物模型mir-17家族表達(dá)量變化,篩選目標(biāo)mir-17;通過在不同低氧時(shí)間下檢測(cè)mir-17-5p相對(duì)表達(dá)量,進(jìn)行mir-17-5p作用敏感時(shí)間的篩選。5.應(yīng)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)、下調(diào)mir-17-5p,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組;通過mtt比色法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組ggmuscs增殖及凋亡。6.通過以下三個(gè)方面檢測(cè)上調(diào)、下調(diào)mir-17-5p后對(duì)ggmuscs線粒體功能的影響:采用透射電鏡觀察細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu);應(yīng)用線粒體膜電位熒光探針檢測(cè)各組跨膜電位不同;通過激光共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察各組ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)變化。7.通過生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)mir-17-5p與線粒體功能相關(guān)的靶基因;通過rt-pcr及westernblot檢測(cè)靶基因mrna及蛋白水平變化,進(jìn)行靶基因的初步確定。結(jié)果1.間歇性低氧模型建立成功,血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示低氧模型組sd大鼠血氧飽和度及氧分壓較對(duì)照組顯著降低(p0.05)。2.he染色、atp酶組織化學(xué)染色顯示:低氧組大鼠頦舌�、蛐图±w維較對(duì)照組增多,提示其能量代謝方式向產(chǎn)能效率低的糖酵解型轉(zhuǎn)變;經(jīng)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn):低氧組大鼠頦舌肌肌纖維間線粒體數(shù)量減少,線粒體水腫,嵴斷裂;以上結(jié)果均提示低氧組大鼠頦舌肌線粒體能量代謝功能受到損傷。3.倒置顯微鏡下觀察到ggmuscs分化成肌管后呈現(xiàn)節(jié)律性收縮;細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示骨骼肌特異性肌球蛋白染色呈陽性,陽染細(xì)胞比例大于95%,表明所培養(yǎng)的ggmuscs純度高,可以應(yīng)用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。4.通過rt-pcr檢測(cè)mir-17家族在低氧模型組中表達(dá)量,確定mir-17-5p為本實(shí)驗(yàn)研究目標(biāo);比較不同低氧時(shí)間mir-17-5p表達(dá)量變化,確定低氧12h為mir-17-5p作用敏感時(shí)間。5.MTT、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:低氧組與常氧組相比,細(xì)胞活性下降,凋亡率升高,表明低氧造成了細(xì)胞損傷;在轉(zhuǎn)染anti-miR-17-5p的低氧組細(xì)胞,其細(xì)胞活性較低氧組降低,凋亡率較低氧組上升,表明抑制miR-17-5p對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了一定的損害;在轉(zhuǎn)染pre-miR-17-5p的低氧組細(xì)胞,其細(xì)胞活性有所恢復(fù),凋亡率較低氧組下降,表明上調(diào)miR-17-5p對(duì)細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。6.通過研究各組細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)、膜電位水平及Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)這三個(gè)與線粒體功能密切相關(guān)的指標(biāo),本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低氧組線粒體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)線粒體嵴斷裂等明顯損傷,線粒體功能受損,其膜電位勢(shì)能較低,Ca2+滯留;在轉(zhuǎn)染anti-miR-17-5p的低氧組細(xì)胞,其超微結(jié)構(gòu)損傷與低氧組無異,但溶酶體吞噬線粒體現(xiàn)象增多,線粒體膜電位勢(shì)能降低,初始鈣滯留濃度較低氧組有所上升,表明抑制miR-17-5p對(duì)線粒體功能產(chǎn)生了傷害;在轉(zhuǎn)染pre-miR-17-5p的低氧組細(xì)胞,其超微結(jié)構(gòu)損傷程度減輕,線粒體膜電位勢(shì)能有所恢復(fù),初始鈣滯留濃度下降,表明上調(diào)miR-17-5p對(duì)線粒體有一定的保護(hù)作用。7.通過生物信息學(xué)分析、RT-PCR及Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),線粒體融合蛋白2(Mfn2)基因與蛋白水平變化與miR-17-5p的變化趨勢(shì)相反,提示Mfn2可能是mi R-17-5p作用于線粒體功能的靶基因。結(jié)論1.通過改良間歇性低壓低氧裝置可以有效的建立OSAHS低氧動(dòng)物模型。2.低氧能夠造成頦舌肌線粒體病理性水腫,肌纖維結(jié)構(gòu)受損,頦舌肌能量代謝方式改變。3.應(yīng)用酶消化+差速貼壁技術(shù)可以有效獲得頦舌肌肌衛(wèi)星細(xì)胞。4.上調(diào)miR-17-5p對(duì)頦舌肌肌衛(wèi)星細(xì)胞線粒體功能有一定的保護(hù)作用。5.Mfn2可能是miR-17-5p作用于線粒體功能的靶基因。
【關(guān)鍵詞】：阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征 間歇性低氧動(dòng)物模型 頦舌肌 mi R-17-5p 線粒體
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R766
【目錄】：

• 縮略語表3-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-14
• 文獻(xiàn)回顧14-29
• 第一部分 阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征14-20
• 第二部分 低氧與 OSAHS 的聯(lián)系20-22
• 第三部分 頦舌肌與 OSAHS 的聯(lián)系22-26
• 第四部分 低氧 mi RNAs 與頦舌肌能量代謝26-29
• 第一部分 低氧影響頦舌肌功能的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)29-39
• 1 材料29-30
• 2 方法30-33
• 3 結(jié)果33-37
• 4 討論37-39
• 第二部分 大鼠頦舌肌肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及低氧mi R175p的確定39-51
• 1 材料39-40
• 2 方法40-45
• 3 結(jié)果45-49
• 4 討論49-51
• 第三部分mi R175p對(duì)頦舌肌肌衛(wèi)星細(xì)胞線粒體功能的影響及其靶基因的初步探索51-66
• 1 材料51-52
• 2 方法52-56
• 3 結(jié)果56-63
• 4 討論63-66
• 全文總結(jié)66-67
• 參考文獻(xiàn)67-74
• 研究成果74

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 侯玉霞;劉月華;;去卵巢雌性大鼠頦舌肌肌功能特征的研究[J];現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志;2007年03期

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10 李勤;李，

本文編號(hào)：409469