目的:研究不同血清型腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)載體介導(dǎo)的外源基因在視網(wǎng)膜中的表達效率,同時比較AAV載體和兩種眼科常用啟動子組合后轉(zhuǎn)染小鼠視網(wǎng)膜的表達效率高低,為視網(wǎng)膜色素變性基因治療選擇合適的AAV載體與啟動子提供依據(jù)。方法:AAV病毒根據(jù)衣殼蛋白不同可分為不同血清型,本課題選取視網(wǎng)膜疾病基因治療中常用的AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9四種血清型AAV載體,并以綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作為報告基因,用GFP的表達強度判斷AAV載體介導(dǎo)的外源基因在視網(wǎng)膜中的表達效率。AAV載體純化后滴度為1. 00×1013mg/L,注射1μL至C57BL/6J小鼠視網(wǎng)膜下腔,于2周取眼球做成冰凍切片,在共聚焦顯微鏡下觀察GFP在小鼠視網(wǎng)膜各層的表達情況。選取在感光細胞內(nèi)特異性表達最強的AAV2/8于第4周取眼球冰凍切片繼續(xù)觀察是否能持續(xù)穩(wěn)定表達。隨后選取眼科基因治療最常用的廣譜啟動子CMV和由CMV增強子與雞β-肌動蛋白啟動子組成的CAG啟動子,并構(gòu)建AAV2/8-GFP-CMV和AAV2...

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【文章目錄】：
1 資料與方法
    1.1 實驗動物
    1.2 主要實驗試劑與儀器
    1.3 AAV病毒載體構(gòu)建與包裝
    1.4 視網(wǎng)膜下腔注射
    1.5 小鼠眼球處理
    1.6 免疫熒光染色與采圖
2 結(jié)果
    2.1 視網(wǎng)膜下腔注射
    2.2 不同血清型AAV載體攜帶的GFP報告基因在小鼠視網(wǎng)膜的表達
3 討論



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