目的:本研究通過觀察NSCs和OECs聯(lián)合移植對SNHL模型大鼠耳蝸細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)因子,凋亡及抗凋亡蛋白因子表達(dá)影響,探討細(xì)胞移植對SNHL損傷耳蝸細(xì)胞保護(hù)作用的部分機(jī)制。方法:（1）細(xì)胞培養(yǎng):選取胎鼠作為移植細(xì)胞組織來源,對NSCs和OECs培養(yǎng)、形態(tài)觀察及鑒定。（2）動(dòng)物造模:采用慶大霉素對大鼠進(jìn)行SNHL造模,將篩選出符合要求的大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組,每組10只,實(shí)驗(yàn)組予NSCs和OECs聯(lián)合移植,對照組予輸注人工外淋巴液代替細(xì)胞移植。（3）細(xì)胞移植:將熒光標(biāo)記的NSCs和OECs通過圓窗植入耳蝸內(nèi),術(shù)后記錄各組大鼠體重變化,檢測大鼠ABR聽力閾值變化和聽覺耳動(dòng)反射閾值,并采集樣本檢測。（4）耳蝸切片HE染色。（5）耳蝸免疫熒光染色檢測移植后NSCs和OECs熒光標(biāo)記物。（6）TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)和MOD值。（7）免疫組織化學(xué)法檢測神經(jīng)營養(yǎng)因子及凋亡免疫陽性細(xì)胞。（8）Western-blot法檢測樣本BDNF、NT-3和Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)影響。結(jié)果:（1）細(xì)胞培養(yǎng)鑒定結(jié)果:NSCs染色鑒定標(biāo)記物呈nestin陽性,OECs染色鑒定標(biāo)記... 

【文章來源】：南昌大學(xué)江西省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

雌雄大鼠合籠交配

第2章材料與方法132.3.5慶大霉素耳毒性大鼠模型的建立方法耳毒性動(dòng)物模型建立方法步驟：首先將SD大鼠先分為兩組，空白組5只（正常飼養(yǎng)，未行任何處理）；造模組25只，參照Murillo-CuestaS等人造模方法[27、28]，造模組大鼠按每100mg/kg/d肌注慶大霉素注射液，連續(xù)用藥2周，每日準(zhǔn)時(shí)注射藥物，在造模前及用藥14d后檢測大鼠ABR閾值，篩選符合聽力要求大鼠。2.3.6實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥根據(jù)文獻(xiàn)[27]方法在造模后篩選ABR檢測閾值上升20dB以上的大鼠作為實(shí)驗(yàn)對象，本次造模共篩選出20只符合要求的大鼠，接著將造模成功后的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組:予10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，觀察大鼠四肢腱反射消失后固定四肢，耳后皮膚剃毛，酒精消毒，手術(shù)刀片在耳后做弧形切口，組織剪分離皮下及肌肉組織，輕巧分離至聽泡位置，暴露聽泡，聽泡上開一小孔，顯示耳蝸底回、圓窗膜及鐙骨動(dòng)脈等解剖標(biāo)志，鏡下確定圓窗膜位置，用10μl微量注射器抽取4μl預(yù)先配備好的NSCs和OECs共培養(yǎng)細(xì)胞懸液，移植前將兩者的濃度調(diào)整為1×105個(gè)/μl，將連接到微量注射器的細(xì)管的細(xì)端輕輕置入圓窗膜處，啟動(dòng)微量移液泵，時(shí)間設(shè)置為5min，緩慢將細(xì)胞懸液通過圓窗注入耳蝸，注射完畢后靜置注射器3min，取就近小塊肌漿組織封閉圓窗龕，當(dāng)圓窗處無液體流出后，用骨水泥封閉聽泡上的缺損，局部消毒，然后逐層縫合關(guān)閉。對照組：予滴入等量人工外淋巴液代替，術(shù)后保暖，正常飼養(yǎng)。圖2大鼠手術(shù)部位

第2章材料與方法15的EDTA中，室內(nèi)常溫脫鈣2周后取出耳蝸，經(jīng)PBS清洗3次，放入20%的蔗糖24h后OCT浸透包埋，在平行于蝸軸方向，用切片機(jī)制作約8um厚度的切片，制備完成后放入-80oC超低溫冰箱內(nèi)保存，待用。圖3大鼠耳蝸標(biāo)本2.3.10切片染色操作步驟如下：①將制備好的耳蝸切片分別放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各15min，使切片脫蠟。②將耳蝸切片依次放入無水乙醇Ⅰ，無水乙醇Ⅱ各5min，洗脫耳蝸組織中殘留的二甲苯，放入80%乙醇15min，充分水化。③切片使用自來水浸洗3min，避免直接水沖，接著使用蘇木精液染色5min，用流水洗去蘇木精液。④接著放入1%鹽酸酒精進(jìn)行分化5s，再次自來水流動(dòng)浸洗1min。接著將切片浸入0.5%伊紅液染色3min，蒸餾水浸洗10s，最后依次分別置入80%乙醇30s，95%乙醇30s，無水乙醇Ⅰ1min，無水乙醇Ⅱ5min，切片脫水。⑤最后將耳蝸切片依次放入二甲苯Ⅰ2min，二甲苯Ⅱ5min，二甲苯Ⅲ5min，耳蝸切片烘干后，中性樹膠、甘油封固片，顯微鏡下觀察大鼠耳蝸切片的細(xì)胞形態(tài)變化。2.3.11耳蝸免疫熒光染色操作步驟如下：將耳蝸切片用PBS漂洗3次，每次5min，置入0.1%TritonX-100和5%山羊血清混合室溫封閉60min。接著移去封閉液，PBS漂洗3次，滴加一抗，各組在4℃孵育過夜，PBS漂洗3次；滴加二抗，按1:100稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育2h，PBS漂洗3次x5min，DAPI工作液染核，室溫下避光孵育10min。最后用0.3%TitonX-100PBS洗滌三遍，每遍5min洗滌，貼片，封

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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本文編號(hào)：3603401