本文關(guān)鍵詞：人iPSCs誘導(dǎo)分化為角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分:iPSCs條件培養(yǎng)基促進(jìn)B-CECs生長(zhǎng)的研究目的:評(píng)估iPSCs條件培養(yǎng)液(iPSCs-derived conditioned medium,iPSCs-CM)對(duì)B-CECs生長(zhǎng)的作用。方法:利用0.22μm的過(guò)濾器濾過(guò)后-80℃冷凍儲(chǔ)存的方法收集已經(jīng)使用過(guò)的iPSCs培養(yǎng)基,按一定比例添加收集的培養(yǎng)基到普通內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(corneal endothelial medium,CEM)中培養(yǎng)B-CECs即為實(shí)驗(yàn)組,未添加的為對(duì)照組。通過(guò)CCK-8,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡情況,活細(xì)胞計(jì)數(shù)及Western blot對(duì)磷酸化的Akt蛋白表達(dá)量的檢測(cè)驗(yàn)證條件培養(yǎng)基對(duì)于角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的影響;通過(guò)PCR,免疫熒光染色,劃痕實(shí)驗(yàn),熒光素鈉滲透實(shí)驗(yàn)(fluorescein leakage test,FLT)探討條件培養(yǎng)基對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白基因表達(dá)的影響及對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響;最后通過(guò)ELISA對(duì)條件培養(yǎng)基有效成分進(jìn)行分析。結(jié)果:25%iPSCs-CM是培養(yǎng)B-CECs的最佳濃度。細(xì)胞培養(yǎng)到第4代實(shí)驗(yàn)組形態(tài)仍維持均一六角形,而對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞不規(guī)則增大失去六邊形結(jié)構(gòu)。免疫熒光染色示B-CECs在iPSCs-CM和CEM中均可表達(dá)ZO-1,Na+/K+-ATPase。定量分析Ki67,Na+/K+-ATPase,Col4A,Col8A基因表達(dá),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞基因表達(dá)量明顯上調(diào)(P0.05,n=3)。同時(shí),細(xì)胞周期檢測(cè)示,進(jìn)入S期和G2期細(xì)胞比率實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組高,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)4代的B-CECs凋亡細(xì)胞較對(duì)照組少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,n=3)。在劃痕實(shí)驗(yàn)及熒光素鈉滲透實(shí)驗(yàn)中,同對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞移行效率更高且在傳4代過(guò)后具有更好的屏障功能。機(jī)理分析發(fā)現(xiàn),經(jīng)饑餓處理后的細(xì)胞,在添加實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基后磷酸化的Akt持續(xù)高表達(dá)到180min,而對(duì)照組表達(dá)量則逐漸減少。這一發(fā)現(xiàn)表明,iPSCs-CM可能通過(guò)上調(diào)PI 3-kinase信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,是iPSCs-CM促進(jìn)B-CECs細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。條件培養(yǎng)液有效成分分析發(fā)現(xiàn),Actvin A表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組明顯升高,培養(yǎng)基添加Actvin A后,可使B-CEC細(xì)胞形態(tài)維持跟條件培養(yǎng)基相類似的六邊形形態(tài)。結(jié)論:iPSCs-CM可有效促進(jìn)B-CECs增殖同時(shí)保持內(nèi)皮細(xì)胞的功能,Actvin A是其促進(jìn)細(xì)胞增殖、維持細(xì)胞形態(tài)的有效成分之一,其促增殖的機(jī)理與磷酸化的Akt持續(xù)高表達(dá)有關(guān)。第二部分:transwell接觸共培養(yǎng)促進(jìn)單散ipscs細(xì)胞生長(zhǎng)及分化目的:觀察transwell接觸共培養(yǎng)促進(jìn)單散細(xì)胞人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells,ipscs)生長(zhǎng)及分化的作用。方法:將1-2代牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞(bovinecornealendothelialcells,b-cecs)接種在transwell小室底面培養(yǎng)8h后,應(yīng)用accutase酶消化及40μm過(guò)濾處理獲得ipscs單散細(xì)胞,將其接種到已有cecs的transwell小室內(nèi)共培養(yǎng)14d,前3d使用mtesr1培養(yǎng)基,第4d開始用含10%胎牛血清的低糖dmem培養(yǎng)基。分別進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,pcr)、免疫熒光、死活細(xì)胞染色及堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ap)染色,對(duì)ipscs多能特性表達(dá)及分化進(jìn)行鑒定。設(shè)定ipscs單散細(xì)胞共培養(yǎng)組為實(shí)驗(yàn)組,常規(guī)培養(yǎng)ipscs組為對(duì)照組一,非共培養(yǎng)ipscs單散細(xì)胞組為對(duì)照組二。結(jié)果:培養(yǎng)b-cecs形態(tài)呈典型的六邊形鋪路石樣外觀,人ipscs呈克隆樣生長(zhǎng),共培養(yǎng)3d后ipscs貼壁呈單散細(xì)胞生長(zhǎng),免疫熒光檢測(cè)未分化標(biāo)志nanog和oct4呈陽(yáng)性,qpcr檢測(cè)nanog、oct4、sox2基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組一比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05,n=3)。死活細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)組死細(xì)胞明顯減少,與對(duì)照組二比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001,n=3)。共培養(yǎng)14d后,人ipscs細(xì)胞形態(tài)比較均一,呈多邊形,體積增大,無(wú)明顯克隆團(tuán)塊。ap染色陰性,免疫熒光染色cd31表達(dá)陽(yáng)性,cd34和cd133表達(dá)陰性。結(jié)論:與b-cecs共培養(yǎng)可增強(qiáng)人單散細(xì)胞ipscs活性,使ipscs形態(tài)上向內(nèi)皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化,表達(dá)部分角膜內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志。transwell接觸共培養(yǎng)模型可以促進(jìn)單散細(xì)胞ipscs生長(zhǎng)及分化。第三部分:ipscs誘導(dǎo)分化為角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究目的:觀察transwell接觸共培養(yǎng)聯(lián)合小分子誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells,ipscs)分化為角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞的作用。方法:在transwell條件下建立b-cecs與ipscs接觸共培養(yǎng)體系(具體方法同第一部分),生物模擬角膜內(nèi)皮胚胎發(fā)育前后過(guò)程序貫添加小分子發(fā)育誘導(dǎo)劑,首先誘導(dǎo)ipscs分化為神經(jīng)嵴樣細(xì)胞(1μmgsk3βinhibitorvi+10μmsb431542)10d,進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)嵴樣細(xì)胞分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞(1μmgsk3βinhibitorvi+1μmra+5ng/mltgf-β2)4d,最后誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞(1μmgsk3βinhibitorvi+5ng/mltgf-β2+1μmy-27632)7d。誘導(dǎo)結(jié)束后進(jìn)行倒置顯微鏡觀察,拍照記錄細(xì)胞形態(tài)變化,pcr、免疫熒光、堿性磷酸酶(alkalinephosphatase AP)染色檢測(cè)相關(guān)標(biāo)志基因及蛋白表達(dá)情況,最后對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行掃描電鏡(scanning electron microscope SEM)觀察其形態(tài)的顯微變化。設(shè)定iPSCs共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化組為實(shí)驗(yàn)組,常規(guī)培養(yǎng)iPSCs組為對(duì)照組。結(jié)果:經(jīng)過(guò)10d的神經(jīng)嵴誘導(dǎo)后,iPSCs細(xì)胞體積明顯增大,形態(tài)拉長(zhǎng)呈長(zhǎng)梭形。經(jīng)過(guò)4d的內(nèi)皮祖細(xì)胞誘導(dǎo),細(xì)胞形態(tài)縮短,逐漸變圓,呈不規(guī)則形,免疫熒光染色內(nèi)皮祖細(xì)胞標(biāo)志Pitx2表達(dá)陽(yáng)性,RT-PCR電泳條帶誘導(dǎo)后細(xì)胞Pixt2呈陽(yáng)性表達(dá),而對(duì)照組表達(dá)陰性。最后經(jīng)過(guò)7d的內(nèi)皮樣細(xì)胞誘導(dǎo),細(xì)胞形態(tài)逐漸均一,呈較典型的六邊形鋪路石樣外觀,無(wú)明顯克隆團(tuán)塊,掃描電鏡可見細(xì)胞單層分布,體積飽滿,胞漿豐富,形態(tài)規(guī)則,表面大量微絨毛,突觸連接緊密;AP染色陰性,而對(duì)照組可見大量克隆團(tuán)樣生長(zhǎng)細(xì)胞,AP染色陽(yáng)性;免疫熒光染色內(nèi)皮標(biāo)志AQP1、ZO-1、Na+/K+-ATPase表達(dá)陽(yáng)性,而對(duì)照組除ZO-1呈弱陽(yáng)性表達(dá)外其余均表達(dá)陰性;qPCR檢測(cè)Nanog、Oct4、Sox2基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較表達(dá)量明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001,n=3)。結(jié)論:利用transwell與B-CECs接觸式共培養(yǎng)同時(shí)序貫添加小分子誘導(dǎo)劑,iPSCs可逐步誘導(dǎo)分化為角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞,表達(dá)部分角膜內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志。生物模擬角膜內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育可促進(jìn)iPSCs向角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞分化。
【關(guān)鍵詞】：單細(xì)胞iPSCs 角膜內(nèi)皮細(xì)胞 transwell接觸共培養(yǎng) iPSCs條件培養(yǎng)基 神經(jīng)嵴細(xì)胞 內(nèi)皮祖細(xì)胞 小分子誘導(dǎo)劑
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R772.2
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-11
• 前言11-25
• 參考文獻(xiàn)17-25
• 第一部分 iPSCs 條件培養(yǎng)基促進(jìn)牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的研究25-48
• 引言25
• 材料和方法25-32
• 結(jié)果32-41
• 討論41-45
• 參考文獻(xiàn)45-48
• 第二部分 transwell 接觸共培養(yǎng)促進(jìn)單散 iPSCs 細(xì)胞生長(zhǎng)及分化48-59
• 引言48
• 材料與方法48-52
• 結(jié)果52-55
• 討論55-57
• 參考文獻(xiàn)57-59
• 第三部分 iPSCs誘導(dǎo)分化為角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究59-72
• 引言59
• 材料與方法59-63
• 結(jié)果63-67
• 討論67-69
• 參考文獻(xiàn)69-72
• 全文總結(jié)72-73
• 問(wèn)題和展望73-74
• 主要英文名詞縮略表74-75
• 在校期間發(fā)表論文及科研成果75-76
• 致謝76

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本文編號(hào)：353444