鑒于動物研究在基礎(chǔ)研究中的重要作用,近年來幾種在人眼視網(wǎng)膜成像中廣泛應(yīng)用的光學(xué)成像技術(shù)也在動物視網(wǎng)膜中得到了成功應(yīng)用,無需組織學(xué)切片即可實現(xiàn)對動物視網(wǎng)膜的高精度細(xì)胞級別成像,這為使用動物視網(wǎng)膜進(jìn)行基礎(chǔ)研究的科研工作者提供了強有力的工具。與之相應(yīng)的是,動物視網(wǎng)膜的研究工作中也開發(fā)了一些新型的、可以應(yīng)用于人眼的成像技術(shù),或者增強了對人眼視網(wǎng)膜功能機理的理解。結(jié)合自身在小鼠視網(wǎng)膜多種活體成像方式上的技術(shù)積累和研究經(jīng)歷,從若干方面闡述了近年來在小鼠和人眼視網(wǎng)膜高精度光學(xué)成像領(lǐng)域出現(xiàn)的技術(shù)突破,側(cè)重于展示當(dāng)前技術(shù)所能達(dá)到的成像水平,希望能起到拋磚引玉的效果,為促進(jìn)動物視網(wǎng)膜影像和人眼視網(wǎng)膜影像之間的相互交流和相互促進(jìn)起到積極的作用。 

【文章來源】：中國激光. 2020,47(02)北大核心EICSCD

【文章頁數(shù)】：28 頁

【部分圖文】：

小鼠眼球與人類眼球的對比。(a)人眼示意圖[21];(b)小鼠眼球示意圖[21];

因為光線必須要經(jīng)過角膜和晶狀體,因此視網(wǎng)膜活體成像需要考慮眼睛光學(xué)系統(tǒng)對成像光路的影響。簡單來講,可以把光路分為入射光路和出射光路,如圖3(a)所示,如果入射光為會聚光,那么入射光經(jīng)過眼睛光學(xué)系統(tǒng)后變?yōu)榘l(fā)散光從而覆蓋較大部分的視網(wǎng)膜,從視網(wǎng)膜每一點散射回來的光線經(jīng)過眼睛的光學(xué)系統(tǒng)后變?yōu)槠叫泄?因此需要面陣的接收器件,如CCD或者CMOS來收集這些光線并將其轉(zhuǎn)化成圖像信號,這即為眼底相機的工作原理[圖3(b)]。眼底相機起源于20世紀(jì)前半葉[34-35],最早于1925年由德國的卡爾·蔡司公司研制出來,經(jīng)過多年的持續(xù)優(yōu)化與改進(jìn),目前已發(fā)展出多種形式,包括最為常見的臺式設(shè)備和近年來興起的手持式設(shè)備,這些設(shè)備可以對視網(wǎng)膜的血管網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行寬視場觀察與彩色成像,成為臨床診斷的重要參考。小鼠視網(wǎng)膜眼底照相技術(shù)起源于20世紀(jì)90年代[36-37],通常具有反射光和熒光成像等模態(tài),如圖4(a)～(c)所示,其主要特點是系統(tǒng)簡單、速度快、成本低,實際應(yīng)用中,為了避免角膜中心的反射光線,通常將其入射光路設(shè)計為環(huán)形,如圖3(a)中插圖i所示,亦有通過鞏膜進(jìn)行照明的研究,如圖3(a)中插圖ii所示[38-39]。但是因為亮視場照明和成像時,視網(wǎng)膜上所有反射光均被相機采集,造成圖像對比度較低[圖4(a)、(b)],且通常其視場和像素固定,無法隨需修改,即使經(jīng)數(shù)字放大和平均后對成像細(xì)節(jié)的改善也很有限[圖4(c)、(d)]。20世紀(jì)80年代研究人員發(fā)明了基于激光點掃描的檢眼鏡技術(shù)(SLO)[40-41],盡管現(xiàn)在的SLO通常使用寬帶光源而不是激光,如超輻射二極管(SLD)等來降低成像散斑噪聲,其方法的本質(zhì)是一樣的,因此使用SLO來統(tǒng)稱這一類技術(shù)。若只考慮入射光線和出射光線[圖3(a)中插圖iii和圖3(c)],SLO使用平行光作為入射光線,其經(jīng)眼睛的光學(xué)系統(tǒng)后在視網(wǎng)膜上會聚為一點,經(jīng)視網(wǎng)膜組織散射后的出射光線經(jīng)晶狀體準(zhǔn)直為平行光。因為出射光線只攜帶視網(wǎng)膜上單個像素點的反射信息,因此需要選用點探測器來進(jìn)行光電圖像轉(zhuǎn)換,如光電倍增管(PMT)等。使用點掃描技術(shù)進(jìn)行成像的一個好處是:可以通過控制掃描范圍或者調(diào)整掃描點數(shù)量來對感興趣的區(qū)域?qū)崿F(xiàn)高密度的采樣,從而得到清晰的圖像[圖4(e)～(h)];更重要的是,其可以與共聚焦技術(shù)相結(jié)合,通過在與像平面共軛的焦點處添加一個小孔[圖3(c)]來選擇性地收集反射光,這不僅消除了焦點之外的光線,增強了圖像的對比度[圖4(e)～(f)],也使得SLO具有一定的層切能力,可以實現(xiàn)對視網(wǎng)膜軸向不同部分的成像。因此,SLO的本質(zhì)是一個應(yīng)用在視網(wǎng)膜活體成像上的激光掃描共聚焦顯微鏡,其可加裝各種熒光探針,或者集成雙光子等高級成像技術(shù),實現(xiàn)亞細(xì)胞級別的活體成像。圖3(a)中插圖iv是近年來新開發(fā)的基于斜入射光的傾角激光掃描檢眼鏡技術(shù)[42]。

20世紀(jì)80年代研究人員發(fā)明了基于激光點掃描的檢眼鏡技術(shù)(SLO)[40-41],盡管現(xiàn)在的SLO通常使用寬帶光源而不是激光,如超輻射二極管(SLD)等來降低成像散斑噪聲,其方法的本質(zhì)是一樣的,因此使用SLO來統(tǒng)稱這一類技術(shù)。若只考慮入射光線和出射光線[圖3(a)中插圖iii和圖3(c)],SLO使用平行光作為入射光線,其經(jīng)眼睛的光學(xué)系統(tǒng)后在視網(wǎng)膜上會聚為一點,經(jīng)視網(wǎng)膜組織散射后的出射光線經(jīng)晶狀體準(zhǔn)直為平行光。因為出射光線只攜帶視網(wǎng)膜上單個像素點的反射信息,因此需要選用點探測器來進(jìn)行光電圖像轉(zhuǎn)換,如光電倍增管(PMT)等。使用點掃描技術(shù)進(jìn)行成像的一個好處是:可以通過控制掃描范圍或者調(diào)整掃描點數(shù)量來對感興趣的區(qū)域?qū)崿F(xiàn)高密度的采樣,從而得到清晰的圖像[圖4(e)～(h)];更重要的是,其可以與共聚焦技術(shù)相結(jié)合,通過在與像平面共軛的焦點處添加一個小孔[圖3(c)]來選擇性地收集反射光,這不僅消除了焦點之外的光線,增強了圖像的對比度[圖4(e)～(f)],也使得SLO具有一定的層切能力,可以實現(xiàn)對視網(wǎng)膜軸向不同部分的成像。因此,SLO的本質(zhì)是一個應(yīng)用在視網(wǎng)膜活體成像上的激光掃描共聚焦顯微鏡,其可加裝各種熒光探針,或者集成雙光子等高級成像技術(shù),實現(xiàn)亞細(xì)胞級別的活體成像。圖3(a)中插圖iv是近年來新開發(fā)的基于斜入射光的傾角激光掃描檢眼鏡技術(shù)[42]。光學(xué)相干層析(OCT)技術(shù)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的基于短相干光源干涉成像的一種技術(shù)[43],通常使用SLD、超連續(xù)譜光源(Supercontinuum Laser)或者掃頻光源(Swept Source)等。與SLO類似,主流的OCT技術(shù)亦是基于點掃描逐點成像,平行的入射光經(jīng)眼睛成像系統(tǒng)聚焦到視網(wǎng)膜上,其反射光線經(jīng)晶狀體準(zhǔn)直后與參考臂光線干涉并由光譜儀或者光電探測器記錄其信號,進(jìn)一步通過傅里葉變換提取出深度方向的反射信息[圖3(a)中插圖v和圖3(d)],因此非常適合對多層結(jié)構(gòu)的視網(wǎng)膜進(jìn)行三維成像[圖4(i)～(j)]。對比圖4(e)和(i),可以看出,OCT利用相干門(Coherent Gate)進(jìn)一步消除了系統(tǒng)中來自透鏡表面的背反射光(圖像無中心亮斑)。OCT自發(fā)明以來,獲得了高速的發(fā)展,尤其是從時域[43-44]到頻域[45-47]的突破,使得OCT在成像速度、靈敏度和信噪比等方面均得到了大幅提高[48-49],而掃頻OCT則在維持高靈敏度和信噪比的情況下進(jìn)一步提高了成像速度[50]。作為對比,文獻(xiàn)報道的時域OCT速度可達(dá)8 kHz[51];而單個CCD光譜儀的頻域OCT則可達(dá)到312.5 kHz[52];若使用多個光譜儀,其速度可達(dá)1 MHz[53];掃頻OCT則可以實現(xiàn)數(shù)MHz以上的掃描速度[54-56]。近年來最大的突破是OCT血管造影術(shù)[OCTA,圖4(k)～(l)][57-58],其可通過多種方式實現(xiàn)[59-63],以Phase-variance方法為例[60],該方法通過在同一位置處進(jìn)行多次重復(fù)掃描得到多張OCT B-scan圖像,通過提取出單個像素上的相位變化方差實現(xiàn)對血管網(wǎng)絡(luò)的提取,如圖4(j)所示,血管處快速的血流造成了與血管對應(yīng)的像素相位不停變化,從而通過相位變化方差識別出血流信息。OCT的三維分辨能力可以將不同軸向位置的血管網(wǎng)絡(luò)提取出來,圖4(k)～(l)分別顯示了視網(wǎng)膜血管和脈絡(luò)膜血管,其圖樣截然不同,為研究不同層的血管結(jié)構(gòu)變化提供了便利。臨床上也進(jìn)行了大量的研究工作以比較OCTA與傳統(tǒng)的熒光造影的優(yōu)缺點[64-65],盡管OCTA無法識別如糖尿病性眼病帶來的毛細(xì)血管破裂、泄漏導(dǎo)致的慢速血流信號,其無需造影劑即可對血管三維網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行高精度成像的優(yōu)勢,使得OCTA成為眼科研究與臨床疾病診斷的一個強有力的工具,在腦組織[66]、皮膚[67]等其他血管豐富的領(lǐng)域也得到了廣泛的應(yīng)用。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Developing a contact probe for rodent fundus imaging in a confocal scanning laser ophthalmoscope[J]. 江曉蕓,丁翼晨,王文耀,黃智宇,王志茹,Elie de Lestrange Anginieur,俞玥,李軍,濮鳴亮,任秋實,李長輝.  Chinese Optics Letters. 2016(03)



本文編號：3529370