目的探討泛素E3連接酶Nedd4L在Pendrin泛素化修飾中的作用及對(duì)Pendrin表達(dá)的影響。方法培養(yǎng)293T細(xì)胞,Co-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Nedd4L與Pendrin存在體內(nèi)結(jié)合;構(gòu)建Nedd4L真核細(xì)胞表達(dá)載體;轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后Western Blot檢測(cè)Pendrin的表達(dá)量以及泛素化程度。結(jié)果 Co-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)Nedd4L與Pendrin在293T細(xì)胞中存在體內(nèi)結(jié)合;真核表達(dá)載體構(gòu)建,能夠表達(dá)完整Nedd4L蛋白;轉(zhuǎn)染72h后,Pendrin在293T細(xì)胞中的表達(dá)量降低,泛素化修飾增加,在細(xì)胞膜表面表達(dá)降低。結(jié)論 Nedd4L能夠結(jié)合Pendrin并通過(guò)促進(jìn)其泛素化修飾以及降低細(xì)胞膜表面表達(dá)量。其機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)Pendrin泛素化修飾誘導(dǎo)Pendrin內(nèi)化并進(jìn)入泛素蛋白酶體途徑降解。 

【文章來(lái)源】：中華耳科學(xué)雜志. 2020,18(03)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

a轉(zhuǎn)染48、72、96h后Pendrin在293T細(xì)胞中表達(dá)降低b轉(zhuǎn)染72h后Pendrin在293T膜蛋白中表達(dá)降低。

利用免疫磁珠法及Western印記雜交，檢測(cè)到Nedd4L與Pendrin存在體內(nèi)結(jié)合（圖1a和1b），同樣的方法，我們檢測(cè)到Pendrin可以與泛素結(jié)合（圖1c和1d），這兩個(gè)結(jié)果表明，Pendrin可能是泛素E3連接酶Nedd4L的底物并在其作用下發(fā)生泛素化修飾。2.2 過(guò)表達(dá)Nedd4L能夠促進(jìn)Pendrin泛素化修飾

為了探究Nedd4L與Pendrin在體內(nèi)的相互作用，我們用構(gòu)建的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，72h后收集總蛋白，膜蛋白以及漿蛋白，Western印記雜交檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)，在293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Nedd4L能夠?qū)е翽endrin表達(dá)下降，（t=2.571,P=0.0422,P=0.0143,P=0.0073）（圖3a），膜蛋白下降較漿蛋白顯著，（t=2.306,P=0.0129）（圖3b），這表示Nedd4L很可能在結(jié)合Pendrin后促使其發(fā)生泛素化修飾并通過(guò)泛素蛋白酶體途徑或者溶酶體途徑發(fā)生降解。圖3 a轉(zhuǎn)染48、72、96h后Pendrin在293T細(xì)胞中表達(dá)降低b轉(zhuǎn)染72h后Pendrin在293T膜蛋白中表達(dá)降低。


本文編號(hào)：3491114