目的探討泛素E3連接酶Nedd4L在Pendrin泛素化修飾中的作用及對Pendrin表達的影響。方法培養(yǎng)293T細胞,Co-IP實驗驗證Nedd4L與Pendrin存在體內(nèi)結(jié)合;構(gòu)建Nedd4L真核細胞表達載體;轉(zhuǎn)染293T細胞后Western Blot檢測Pendrin的表達量以及泛素化程度。結(jié)果 Co-IP實驗證實Nedd4L與Pendrin在293T細胞中存在體內(nèi)結(jié)合;真核表達載體構(gòu)建,能夠表達完整Nedd4L蛋白;轉(zhuǎn)染72h后,Pendrin在293T細胞中的表達量降低,泛素化修飾增加,在細胞膜表面表達降低。結(jié)論 Nedd4L能夠結(jié)合Pendrin并通過促進其泛素化修飾以及降低細胞膜表面表達量。其機制可能是通過促進Pendrin泛素化修飾誘導Pendrin內(nèi)化并進入泛素蛋白酶體途徑降解。 

【文章來源】：中華耳科學雜志. 2020,18(03)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

a轉(zhuǎn)染48、72、96h后Pendrin在293T細胞中表達降低b轉(zhuǎn)染72h后Pendrin在293T膜蛋白中表達降低。

利用免疫磁珠法及Western印記雜交，檢測到Nedd4L與Pendrin存在體內(nèi)結(jié)合（圖1a和1b），同樣的方法，我們檢測到Pendrin可以與泛素結(jié)合（圖1c和1d），這兩個結(jié)果表明，Pendrin可能是泛素E3連接酶Nedd4L的底物并在其作用下發(fā)生泛素化修飾。2.2 過表達Nedd4L能夠促進Pendrin泛素化修飾

為了探究Nedd4L與Pendrin在體內(nèi)的相互作用，我們用構(gòu)建的真核表達載體轉(zhuǎn)染293T細胞，72h后收集總蛋白，膜蛋白以及漿蛋白，Western印記雜交檢測，發(fā)現(xiàn)，在293T細胞中過表達Nedd4L能夠?qū)е翽endrin表達下降，（t=2.571,P=0.0422,P=0.0143,P=0.0073）（圖3a），膜蛋白下降較漿蛋白顯著，（t=2.306,P=0.0129）（圖3b），這表示Nedd4L很可能在結(jié)合Pendrin后促使其發(fā)生泛素化修飾并通過泛素蛋白酶體途徑或者溶酶體途徑發(fā)生降解。圖3 a轉(zhuǎn)染48、72、96h后Pendrin在293T細胞中表達降低b轉(zhuǎn)染72h后Pendrin在293T膜蛋白中表達降低。


本文編號：3491114