發(fā)布時(shí)間：2021-11-03 06:15

　　目的:視網(wǎng)膜色素變性（RP）是一種較常見(jiàn)的遺傳眼病,目前尚無(wú)有效的臨床治療手段,因此視網(wǎng)膜疾病相關(guān)基因及病理機(jī)制的研究對(duì)疾病預(yù)防、診斷及治療具有重要意義。REEP6是受體表達(dá)增強(qiáng)蛋白（receptor expression enhancing protein,REEPs）家族成員,Reep6基因有兩種主要形式的異構(gòu)體,其差異為是否含有5號(hào)外顯子。目前已有研究證實(shí)Reep6基因突變會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性,而包含5號(hào)外顯子的異構(gòu)體Reep6.1在視網(wǎng)膜中特異性表達(dá)。因此,本論文通過(guò)敲除小鼠Reep6.1基因5號(hào)外顯子,研究Reep6.1基因在視網(wǎng)膜中的功能和基因突變導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性的病理變化過(guò)程。最終目的是通過(guò)綜合分析Reep6.1以及其它已報(bào)道的視網(wǎng)膜變性相關(guān)基因的功能和作用機(jī)制等,闡述視網(wǎng)膜變性的疾病發(fā)生過(guò)程和發(fā)病機(jī)制并進(jìn)一步探索潛在的RP治療方法。方法:利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Reep6.1基因5號(hào)外顯子敲除小鼠模擬人類視網(wǎng)膜色素變性早期癥狀;采用視網(wǎng)膜電圖（ERG）方法檢測(cè)視網(wǎng)膜功能;用視網(wǎng)膜冰凍切片免疫熒光染色（IHC）和視網(wǎng)膜蛋白免疫印跡（WB）方法分析敲除小鼠的病理組織改變... 

【文章來(lái)源】：電子科技大學(xué)四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：49 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

人眼球和視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)示意圖[1]

實(shí)驗(yàn)安排

電子科技大學(xué)碩士學(xué)位論文14本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)剪切目標(biāo)基因內(nèi)含子的DNA，同時(shí)提供同源模板Donor，通過(guò)DNA的同源重組修復(fù)在特定外顯子兩端插入loxP，同時(shí)在5號(hào)外顯子加入stopcodon，以實(shí)現(xiàn)破壞5號(hào)外顯子翻譯的目的，使得Reep6.1特定外顯子被刪除，從而實(shí)現(xiàn)Reep6.1基因5號(hào)外顯子敲除的目的（如圖2-1所示）。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級(jí)小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房的獨(dú)立通風(fēng)籠具（IVC)系統(tǒng)中，每日光照時(shí)長(zhǎng)大于8小時(shí)，溫度25±2℃，濕度40%~50%。每籠飼養(yǎng)4~5只小鼠，每周更換一次墊料，保證小鼠飼料和水源充足，自由取食飲水。每日觀察記錄小鼠生長(zhǎng)及生育情況。圖2-1小鼠模型構(gòu)建原理。（a）條件性敲除小鼠的技術(shù)原理；（b）loxP和stopcodon敲入破壞5號(hào)外顯子翻譯的原理2.2.2小鼠基因型鑒定2.2.2.1鑒定樣本收集和樣本處理1.幼鼠出生2周后，把每只小鼠剪下一個(gè)不同位置的腳趾作標(biāo)記，剪約0.3厘米長(zhǎng)度的鼠尾作基因鑒定樣本，并編號(hào)登記。2.收集剪下的鼠尾和腳趾樣本至干凈的EP管，每個(gè)樣本加入70μL動(dòng)物組織DNA提取液A（40mM的NaOH+0.4mM的EDTA），95℃金屬浴中煮30分鐘，金屬浴中可拿出EP管搖勻，加快組織溶解。3.組織基本溶解完全后，取出冷卻至室溫，加入70μL動(dòng)物組織DNA提取液B（40mMTris-HCl）以中和提取液A中的NaOH，混勻。4.處理好的小鼠DNA組織樣品即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將樣本置于－20℃冰箱則可保存較長(zhǎng)時(shí)間。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]視網(wǎng)膜色素變性分類的研究進(jìn)展[J]. 邢怡橋,黃蓉,李敏.  臨床眼科雜志. 2017(02)



本文編號(hào)：3473209