發(fā)布時間：2021-11-03 06:15

　　目的:視網膜色素變性（RP）是一種較常見的遺傳眼病,目前尚無有效的臨床治療手段,因此視網膜疾病相關基因及病理機制的研究對疾病預防、診斷及治療具有重要意義。REEP6是受體表達增強蛋白（receptor expression enhancing protein,REEPs）家族成員,Reep6基因有兩種主要形式的異構體,其差異為是否含有5號外顯子。目前已有研究證實Reep6基因突變會導致視網膜變性,而包含5號外顯子的異構體Reep6.1在視網膜中特異性表達。因此,本論文通過敲除小鼠Reep6.1基因5號外顯子,研究Reep6.1基因在視網膜中的功能和基因突變導致視網膜變性的病理變化過程。最終目的是通過綜合分析Reep6.1以及其它已報道的視網膜變性相關基因的功能和作用機制等,闡述視網膜變性的疾病發(fā)生過程和發(fā)病機制并進一步探索潛在的RP治療方法。方法:利用CRISPR/Cas9技術構建Reep6.1基因5號外顯子敲除小鼠模擬人類視網膜色素變性早期癥狀;采用視網膜電圖（ERG）方法檢測視網膜功能;用視網膜冰凍切片免疫熒光染色（IHC）和視網膜蛋白免疫印跡（WB）方法分析敲除小鼠的病理組織改變... 

【文章來源】：電子科技大學四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數】：49 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

人眼球和視網膜結構示意圖[1]

實驗安排

電子科技大學碩士學位論文14本實驗利用CRISPR/Cas9基因編輯技術剪切目標基因內含子的DNA，同時提供同源模板Donor，通過DNA的同源重組修復在特定外顯子兩端插入loxP，同時在5號外顯子加入stopcodon，以實現破壞5號外顯子翻譯的目的，使得Reep6.1特定外顯子被刪除，從而實現Reep6.1基因5號外顯子敲除的目的（如圖2-1所示）。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級小動物實驗房的獨立通風籠具（IVC)系統(tǒng)中，每日光照時長大于8小時，溫度25±2℃，濕度40%~50%。每籠飼養(yǎng)4~5只小鼠，每周更換一次墊料，保證小鼠飼料和水源充足，自由取食飲水。每日觀察記錄小鼠生長及生育情況。圖2-1小鼠模型構建原理。（a）條件性敲除小鼠的技術原理；（b）loxP和stopcodon敲入破壞5號外顯子翻譯的原理2.2.2小鼠基因型鑒定2.2.2.1鑒定樣本收集和樣本處理1.幼鼠出生2周后，把每只小鼠剪下一個不同位置的腳趾作標記，剪約0.3厘米長度的鼠尾作基因鑒定樣本，并編號登記。2.收集剪下的鼠尾和腳趾樣本至干凈的EP管，每個樣本加入70μL動物組織DNA提取液A（40mM的NaOH+0.4mM的EDTA），95℃金屬浴中煮30分鐘，金屬浴中可拿出EP管搖勻，加快組織溶解。3.組織基本溶解完全后，取出冷卻至室溫，加入70μL動物組織DNA提取液B（40mMTris-HCl）以中和提取液A中的NaOH，混勻。4.處理好的小鼠DNA組織樣品即可進行PCR擴增。將樣本置于－20℃冰箱則可保存較長時間。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]視網膜色素變性分類的研究進展[J]. 邢怡橋,黃蓉,李敏.  臨床眼科雜志. 2017(02)



本文編號：3473209