目的1、通過基于iTRAQ技術(shù)的蛋白質(zhì)譜分析對(duì)吸煙者血清和非吸煙者血清作用于ARMS2/HTRA1高危型及野生型RPE細(xì)胞前后蛋白質(zhì)譜的測(cè)定,篩選組間差異蛋白,并對(duì)其進(jìn)行功能和通路富集分析,探究吸煙與ARMS2/HTRA1高�；蛐驮贏MD發(fā)病中的作用機(jī)制,尋找二者之間關(guān)聯(lián)及影響的直接證據(jù)。2、應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行靶基因修飾,建立ARMS2高危型、HTRA1高危型純合優(yōu)化干細(xì)胞系,從而達(dá)到將緊密連鎖的ARMS2/HTRA1高�；蚍珠_研究的目的,為之后特異性的分析ARMS2以及HTRA1的分子生物學(xué)特性,明確AMD真正的致病基因提供了細(xì)胞模型。方法1、從預(yù)篩選的健康人群分別收集吸煙者血清和非吸煙者血清,探索最佳血清作用濃度。收集角膜移植后的供體眼球,分離培養(yǎng)ARMS2/HTRA1高危型及野生型個(gè)體來源的人原代RPE細(xì)胞。同時(shí),將ARMS2/HTRA1高危型及野生型個(gè)體來源的iPSCs定向誘導(dǎo)分化為iPSCs-RPE細(xì)胞。將預(yù)混的吸煙者血清和非吸煙者血清分別作用于ARMS2/HTRA1高危型及野生型的原代RPE細(xì)胞7天后,提取各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞總蛋白,進(jìn)行基于i... 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學(xué)天津市 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：123 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

顯微鏡下iPSCs-RPE細(xì)胞形態(tài)100x(左)，200x(右)

異性標(biāo)志物 RPE65、ZO-1 進(jìn)行免疫熒光染色鑒定，之后消化傳代及凍存保留細(xì)胞株。RPE 細(xì)胞呈典型的六邊形結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)有色素沉著，RPE65、ZO-1 熒光染色陽(yáng)性。共計(jì)獲得眼球 4 個(gè)，來源于 4 個(gè)不同個(gè)體，培養(yǎng)得到 RPE 細(xì)胞株 4 株，根據(jù)獲得捐獻(xiàn)眼球的先后順序分別編號(hào)細(xì)胞株 NO.1-NO.4。經(jīng)過比較 20min，25min，30min，35min 四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差速貼壁法純化 RPE細(xì)胞后，跟其它三個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)差速貼壁時(shí)間點(diǎn)為 30min 時(shí)，細(xì)胞純化效果更好，獲得更多六邊形結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，而且 RPE65 免疫熒光染色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)更多，且呈現(xiàn)出更好的細(xì)胞形態(tài)，因此，我們篩選出差速貼壁法純化 RPE細(xì)胞的最佳時(shí)間點(diǎn)為 30min（圖 1.3）。免疫熒光染色顯示純化后的 RPE 細(xì)胞表達(dá) RPE 細(xì)胞特異性標(biāo)志物 RPE65、ZO-1（圖 1.4）。對(duì)上述不同個(gè)體來源的 RPE 細(xì)胞株進(jìn)行 ARMS2/HTRA1 基因分型篩選。Sanger 測(cè)序結(jié)果表明，培養(yǎng)所得的四株原代 RPE 細(xì)胞系中，NO.1 和 NO.2 為ARMS2/HTRA1 高危型個(gè)體來源，而 NO.3 和 NO.4 為 ARMS2/HTRA1 野生型個(gè)體來源。

圖 1.4 RPE細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征和免疫鑒定。顯微鏡下細(xì)胞呈規(guī)則的六邊形形態(tài)，呈色素狀（左）。RPE 65和ZO-1的免疫熒光染色均為陽(yáng)性，表明細(xì)胞是高度純化的人RPE細(xì)胞（右）。1.2.3 最佳血清作用濃度為 20%根據(jù)血清收集條件的篩選，本實(shí)驗(yàn)中共收集吸煙人群血清 32 例，非吸煙人群血清 35 例，為最大可能消除個(gè)體差異，將多人的吸煙者血清和非吸煙者血清分別混合后，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)激條件。本實(shí)驗(yàn)最佳血清作用濃度條件：最大程度接觸血清但不至于使細(xì)胞死亡。我們將吸煙者血清、非吸煙者血清和胎牛血清分別按濃度梯度（5%，15%，20%，30%）作用于 RPE 細(xì)胞后，通過倒置顯微鏡觀察，細(xì)胞計(jì)數(shù)及 MTT 實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)含 20%血清的培養(yǎng)基作用 7 天是最佳作用條件。顯微鏡下觀察不同濃度吸煙者血清作用 RPE 細(xì)胞后形態(tài)學(xué)變化時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞暴露于較低的血清濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀況穩(wěn)定，但當(dāng)血清濃度增加到 30%時(shí)，出現(xiàn)許多細(xì)胞凋亡漂�。▓D 1.5）。細(xì)胞計(jì)數(shù)和 MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明，20%血清濃度是一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)。當(dāng)血清濃度高于 20%時(shí)，RPE 細(xì)胞的增殖受到抑制，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡（圖 1.6）。

【參考文獻(xiàn)】：
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