目的1、通過基于iTRAQ技術的蛋白質譜分析對吸煙者血清和非吸煙者血清作用于ARMS2/HTRA1高危型及野生型RPE細胞前后蛋白質譜的測定,篩選組間差異蛋白,并對其進行功能和通路富集分析,探究吸煙與ARMS2/HTRA1高�；蛐驮贏MD發(fā)病中的作用機制,尋找二者之間關聯(lián)及影響的直接證據。2、應用CRISPR/Cas9基因編輯技術對干細胞進行靶基因修飾,建立ARMS2高危型、HTRA1高危型純合優(yōu)化干細胞系,從而達到將緊密連鎖的ARMS2/HTRA1高�；蚍珠_研究的目的,為之后特異性的分析ARMS2以及HTRA1的分子生物學特性,明確AMD真正的致病基因提供了細胞模型。方法1、從預篩選的健康人群分別收集吸煙者血清和非吸煙者血清,探索最佳血清作用濃度。收集角膜移植后的供體眼球,分離培養(yǎng)ARMS2/HTRA1高危型及野生型個體來源的人原代RPE細胞。同時,將ARMS2/HTRA1高危型及野生型個體來源的iPSCs定向誘導分化為iPSCs-RPE細胞。將預混的吸煙者血清和非吸煙者血清分別作用于ARMS2/HTRA1高危型及野生型的原代RPE細胞7天后,提取各實驗組的細胞總蛋白,進行基于i... 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學天津市 211工程院校

【文章頁數】：123 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

顯微鏡下iPSCs-RPE細胞形態(tài)100x(左)，200x(右)

異性標志物 RPE65、ZO-1 進行免疫熒光染色鑒定，之后消化傳代及凍存保留細胞株。RPE 細胞呈典型的六邊形結構，胞內有色素沉著，RPE65、ZO-1 熒光染色陽性。共計獲得眼球 4 個，來源于 4 個不同個體，培養(yǎng)得到 RPE 細胞株 4 株，根據獲得捐獻眼球的先后順序分別編號細胞株 NO.1-NO.4。經過比較 20min，25min，30min，35min 四個時間點的差速貼壁法純化 RPE細胞后，跟其它三個時間點比較，我們發(fā)現(xiàn)當差速貼壁時間點為 30min 時，細胞純化效果更好，獲得更多六邊形結構的細胞，而且 RPE65 免疫熒光染色的陽性細胞數更多，且呈現(xiàn)出更好的細胞形態(tài)，因此，我們篩選出差速貼壁法純化 RPE細胞的最佳時間點為 30min（圖 1.3）。免疫熒光染色顯示純化后的 RPE 細胞表達 RPE 細胞特異性標志物 RPE65、ZO-1（圖 1.4）。對上述不同個體來源的 RPE 細胞株進行 ARMS2/HTRA1 基因分型篩選。Sanger 測序結果表明，培養(yǎng)所得的四株原代 RPE 細胞系中，NO.1 和 NO.2 為ARMS2/HTRA1 高危型個體來源，而 NO.3 和 NO.4 為 ARMS2/HTRA1 野生型個體來源。

圖 1.4 RPE細胞的形態(tài)學特征和免疫鑒定。顯微鏡下細胞呈規(guī)則的六邊形形態(tài)，呈色素狀（左）。RPE 65和ZO-1的免疫熒光染色均為陽性，表明細胞是高度純化的人RPE細胞（右）。1.2.3 最佳血清作用濃度為 20%根據血清收集條件的篩選，本實驗中共收集吸煙人群血清 32 例，非吸煙人群血清 35 例，為最大可能消除個體差異，將多人的吸煙者血清和非吸煙者血清分別混合后，作為后續(xù)實驗中的應激條件。本實驗最佳血清作用濃度條件：最大程度接觸血清但不至于使細胞死亡。我們將吸煙者血清、非吸煙者血清和胎牛血清分別按濃度梯度（5%，15%，20%，30%）作用于 RPE 細胞后，通過倒置顯微鏡觀察，細胞計數及 MTT 實驗的方法進行檢測，發(fā)現(xiàn)含 20%血清的培養(yǎng)基作用 7 天是最佳作用條件。顯微鏡下觀察不同濃度吸煙者血清作用 RPE 細胞后形態(tài)學變化時發(fā)現(xiàn)當細胞暴露于較低的血清濃度時，細胞生長狀況穩(wěn)定，但當血清濃度增加到 30%時，出現(xiàn)許多細胞凋亡漂�。▓D 1.5）。細胞計數和 MTT 實驗結果同時表明，20%血清濃度是一個轉折點。當血清濃度高于 20%時，RPE 細胞的增殖受到抑制，細胞出現(xiàn)凋亡（圖 1.6）。

【參考文獻】：
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