目的:探索Nrf2（核因子NF-E2相關(guān)因子）在過氧化氬（H2O2）誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細胞（hLEC）氧化-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聯(lián)合應(yīng)激狀態(tài)下的保護機制,同時求證Nrf2與ATF4（激活轉(zhuǎn)錄因子4）是否在聯(lián)合應(yīng)激過程中發(fā)生相互作用,為延緩年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展尋找新的藥物靶點。方法:hLEC在400μM H2O2中預(yù)培養(yǎng)24h建立聯(lián)合應(yīng)激損傷模型,通過細胞轉(zhuǎn)染分別上調(diào)、下調(diào)hLEC中Nrf2和/或ATF4表達。光鏡下分析細胞形態(tài)、CCK-8法評估細胞存活率、檢測H2O2含量,流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧ROS水平。Western Blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白表達程度、RT-PCR在RNA水平同步驗證;分離細胞質(zhì)及細胞核蛋白,檢測Nrf2、ATF4及其相關(guān)蛋白表達水平、利用免疫共沉淀（Co-IP法）檢測轉(zhuǎn)錄水平上Nrf2和ATF4相互作用程度。分別檢測經(jīng)過Nrf2或ATF4上調(diào)或下調(diào)的hLEC在聯(lián)合應(yīng)激中細胞總抗氧化能力、谷胱甘肽GSH、超氧岐化酶SOD、過氧化氫酶及各項下游Ⅱ相抗氧化酶表達水平。結(jié)果:1.Nrf2增加hLEC在聯(lián)合應(yīng)激中存活,降低H2O2和ROS含量。2.H2O2培養(yǎng)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激... 

【文章來源】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖２?Ｎｒｆ２減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的ＵＰＲ信號通路??（Ａ）ＵＰＲ通路蛋白的Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ結(jié)果

圖３Ｃ中ｍＲＮＡ的差異體現(xiàn)轉(zhuǎn)錄層面細胞內(nèi)應(yīng)對應(yīng)??激的能力高低，針對ＮＨ２的不同干預(yù)Ｎｒｆ２和ｅＩＦ２ａ的ｍＲＮＡ都遵循著“應(yīng)激越??強、表達越高”的規(guī)律

過氧化氫酶（ＣＡＴ）是直接催化細胞中Ｈ２０２的酶類，細胞中過度活躍的活性氧??是干擾細胞氧化平衡的關(guān)鍵因素，與此同時像ＣＡＴ?—類的抗氧化多為直接接受??Ｎｒｆ２的支配參與細胞穩(wěn)態(tài)的維持。圖５Ｄ中ＣＡＴ含量在靜息狀態(tài)下是近２０Ｕ／ｍｇ??ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＣ組），遭受Ｈ２０２直接殺傷后含量從６ｈ的１１．６８?Ｕ／ｍｇ?ｐｒｏｔｅｉｎ下降至２４ｈ??的６．０４Ｕ／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎ�？梢钥闯觯龋玻希驳膿p傷是直接的、即刻的，但Ｎｒｆ２蛋白過??表達處理ｈＬＥＣ后情況發(fā)生了改觀，在尚未形成損傷的Ｏｈ時刻，細胞內(nèi)的ＣＡＴ??含量已經(jīng)收到誘導(dǎo)上升至近３０．０?Ｕ／ｍｇ?ｐｒｏｔｅｉｎ，而在損傷來臨后即使ＣＡＴ有所下??降，但是仍顯示出增強的抵抗能力。ＡＴＦ４過表達的處理同樣能夠提高ＣＡＴ的含??量，但效力不及Ｎｒｆ２。??在前期的研究中我們證實Ｎｒｆ２信號通路下游的蛋白中，ＨＯ－１是在細胞抗氧??化體系中重要的抗氧化物酶［２（）］。此次的結(jié)果（圖５Ｅ）提示在Ｈ２〇２培養(yǎng)的誘導(dǎo)下??ＨＯ－１表達發(fā)生上調(diào)


本文編號：3304548