目的:探究自噬水平變化對高糖誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響及其機(jī)制。方法:人晶狀體上皮細(xì)胞（HLE-B3）分為正常對照組（NC組）和高糖處理組（HG組）,分別用含5.5mmol/L葡萄糖的DMEM和添加了30mmol/L葡萄糖的上述DMEM培養(yǎng)12、24、48h,用Western blot檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白（E-cadherin、α-SMA）和自噬標(biāo)志蛋白（LC3、Beclin 1和SQSTM1/p62）的表達(dá)變化,用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的移行能力以明確高糖對晶狀體上皮細(xì)胞自噬和EMT的影響。利用雷帕霉素調(diào)節(jié)自噬水平,將細(xì)胞分為正常對照組（NC組）、高糖處理組（HG組）,高糖處理細(xì)胞的同時(shí)添加DMSO溶劑組（DMSO組）和添加200nmol/L雷帕霉素的雷帕霉素組（RAPA組）,處理細(xì)胞24h,用Transwell實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的移行能力,用Western blot檢測EMT、自噬標(biāo)志蛋白和TGF-β信號通路蛋白（TGF-β2、Smad2/3、p-Smad2/3、Snail）的表達(dá)。用細(xì)胞免疫熒光染色觀察SQSTM1/p62與Smad2/3在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),免疫共沉淀方... 

【文章來源】：國際眼科雜志. 2020,20(05)北大核心

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【部分圖文】：

HLE-B3細(xì)胞在高糖環(huán)境下發(fā)生EMT

為了探討自噬對HLE-B3細(xì)胞發(fā)生EMT的調(diào)節(jié)作用,我們使用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素(200nmol/L)對高糖刺激的HLE-B3細(xì)胞處理24h,用Western blot檢測HLE-B3細(xì)胞自噬和EMT標(biāo)志蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果表明,與NC組相比,HG組HLE-B3細(xì)胞LC3 Ⅱ/Ⅰ及E-cadherin蛋白表達(dá)降低(P=0.0042、0.0001),而α-SMA蛋白表達(dá)增加(P<0.0001),這與2.1部分的結(jié)果一致;RAPA組與HG組、DMSO組相比,LC3 Ⅱ/Ⅰ、E-cadherin蛋白表達(dá)水平有所提高(P<0.0001、=0.0087;P<0.0001、=0.0245),α-SMA蛋白表達(dá)水平有所降低(P=0.0001、<0.0001),但與NC組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0051、0.0136、<0.0001),DMSO組與HG組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.9997、0.8625、0.7128),見圖3A～D,表4,提示雷帕霉素可逆轉(zhuǎn)高糖引起的自噬水平降低及EMT增強(qiáng)的變化。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與NC組相比,HG組和DMSO組細(xì)胞的移行數(shù)量顯著增加(均P<0.0001),提示高糖促進(jìn)了HLE-B3細(xì)胞的移行,而RAPA組細(xì)胞的移行數(shù)量明顯低于HG組和DMSO組(P=0.0002、0.0004),但仍高于NC組(P=0.0021),提示雷帕霉素對高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞移行有所抑制,與Western Blot結(jié)果相一致(圖3E、F,表4)。表3 高糖環(huán)境對HLE-B3細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平的影響 x ˉ ±s 培養(yǎng)時(shí)間 LC3Ⅱ/Ⅰ Beclin 1 SQSTM1/p62 0h 1.65±0.05 1.13±0.05 0.24±0.03 12h 1.17±0.06b 0.75±0.02b 0.66±0.03b 24h 0.62±0.07b,d 0.49±0.05b,d 0.81±0.02b,d 48h 0.66±0.07b,d 0.43±0.03b,d 0.99±0.04b,d,f F 163 206 302.1 P <0.0001 <0.0001 <0.0001 注:bP<0.01 vs 0h;dP<0.01 vs 12h;fP<0.01 vs 24h。

白內(nèi)障是糖尿病患者視力損害的主要原因之一[14]。白內(nèi)障摘除術(shù)仍是目前唯一有效的治療方法[15]。與非糖尿病患者相比,糖尿病患者出現(xiàn)手術(shù)并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)較高,如囊膜收縮和混濁、黃斑水腫和糖尿病視網(wǎng)膜病變加重等[16]。所以,研究藥物防治糖尿病白內(nèi)障很有必要。人們對糖尿病白內(nèi)障發(fā)病機(jī)理的探索從未停止,陳文靜等[17]發(fā)現(xiàn)高糖可以抑制HLE-B3細(xì)胞葡萄糖關(guān)鍵代謝酶(6-磷酸果糖激酶-1、丙酮酸激酶、己糖激酶、檸檬酸合成酶、α-酮戊二酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶)的表達(dá),從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究采用高糖刺激HLE-B3細(xì)胞以模擬糖尿病患者中晶狀體上皮細(xì)胞的生存狀態(tài),觀察晶狀體上皮細(xì)胞EMT及自噬水平的改變,并通過雷帕霉素干預(yù)自噬水平,觀察對細(xì)胞發(fā)生EMT的影響,探討自噬對晶狀體上皮細(xì)胞EMT的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。表4 雷帕霉素對HLE-B3細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)及遷移的影響 x ˉ ±s 組別 LC3 Ⅱ/Ⅰ E-cadherin α-SMA 遷移細(xì)胞數(shù)(個(gè)) NC組 1.61±0.10 1.16±0.12 0.45±0.05 26.67±3.06 HG組 1.16±0.10a 0.60±0.05a 1.16±0.04a 79.33±7.37a DMSO組 1.17±0.08a 0.65±0.04a 1.21±0.05a 77.00±2.65a RAPA組 2.04±0.14a,c,e 0.89±0.08a,c,e 0.81±0.06a,c,e 49.33±4.04a,c,e F 45.52 31.41 157.2 83.26 P <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 注:aP<0.05 vs NC組;cP<0.05 vs HG組;eP<0.05 vs DMSO組。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞葡萄糖關(guān)鍵代謝酶的表達(dá)[J]. 陳文靜,劉平.  國際眼科雜志. 2019(09)
[2]Ocular complications of diabetes mellitus[J]. Nihat Sayin,Necip Kara,G?khan Pekel.  World Journal of Diabetes. 2015(01)



本文編號：3278553