發(fā)布時(shí)間：2021-07-06 18:29

　　目的:觀察體外高糖誘導(dǎo)環(huán)境,對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中內(nèi)臟脂肪素（Visfatin）的表達(dá)影響,以及研究高糖環(huán)境下重樓皂苷I（Polyphyllin Ⅰ）對(duì)Visfatin表達(dá)情況的影響。方法:人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)后分3組,正常對(duì)照組、高糖組和高糖加Polyphyllin Ⅰ藥物干預(yù)組,干預(yù)培養(yǎng)12h后進(jìn)行檢測(cè)。正常對(duì)照組:5.5mmol/L葡萄糖濃度常規(guī)培養(yǎng);高糖組:將25mmol/L的高糖加入培養(yǎng)基建立模型;高糖加Polyphyllin Ⅰ藥物干預(yù)組:高糖25mmol/L和3μg/L Polyphyllin Ⅰ藥物加入培養(yǎng)基。免疫熒光染色法觀察人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中Visfatin和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)上皮細(xì)胞中Visfatin和VEGF mRNA的表達(dá); Western-blot法檢測(cè)上皮細(xì)胞中Visfatin和VEGF蛋白的表達(dá)。結(jié)果:免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Visfatin和VEGF在正常組視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中表達(dá)呈弱陽(yáng)性。但在高糖組視網(wǎng)膜色素上皮中可見(jiàn)Visfatin和VEGF呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。藥物干預(yù)組中Visfatin和VEGF熒光較高糖組... 

【文章來(lái)源】：國(guó)際眼科雜志. 2020,20(12)北大核心

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【部分圖文】：

人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中Visfatin和VEGF的熒光表達(dá)(×400)

近年來(lái),Visfatin與糖尿病相關(guān)的研究引起了廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病及其血管病變的機(jī)體中,Visfatin表達(dá)量顯著升高,可引發(fā)一系列病理生理改變[9-10]。DR作為糖尿病微血管并發(fā)癥的一種,Visfatin可能同樣參與其中[11]。研究表明DR中纖維血管增殖膜形成與Visfatin的表達(dá)增多有一定關(guān)系[12]。另有報(bào)道指出:DR中視網(wǎng)膜新生血管,可能通過(guò)Visfatin的促炎癥反應(yīng)特性誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,或類(lèi)胰島素效應(yīng)增強(qiáng)蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性形成[13]。然而DR的發(fā)生發(fā)展還由其他多種因素共同參與,本研究觀察了Visfatin在模擬高糖環(huán)境下,人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況及其與VEGF的關(guān)系,并應(yīng)用Polyphyllin I作為干預(yù)抑制劑進(jìn)行DR治療的初步探討,以期發(fā)現(xiàn)與病因相關(guān)的關(guān)鍵作用靶點(diǎn),為DR防治提供新策略。在DR的視網(wǎng)膜細(xì)胞研究中,視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的相關(guān)研究較多,色素上皮細(xì)胞的研究甚少。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞有調(diào)節(jié)眼內(nèi)電解質(zhì)平衡、構(gòu)成血-視網(wǎng)膜屏障及分泌多種生長(zhǎng)因子等保護(hù)及再生作用[14]。本研究中發(fā)現(xiàn),在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的Visfatin表達(dá)升高,推測(cè)高糖環(huán)境下色素上皮細(xì)胞可以分泌Visfatin,并可能與DR的發(fā)生機(jī)制相關(guān)。研究表明,高糖、低氧、機(jī)械損傷、糖基化等影響下,Visfatin可激活膠質(zhì)細(xì)胞,誘導(dǎo)Müller細(xì)胞分泌VEGF使得表達(dá)上調(diào)[7],推測(cè)色素上皮細(xì)胞中可能存在相似的作用方式。而Visfatin和VEGF的表達(dá)升高可能促進(jìn)色素上皮層新生血管形成[15]。色素上皮細(xì)胞的細(xì)胞骨架中相關(guān)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)可直接調(diào)控VEGF的表達(dá)[16]。且細(xì)胞中不僅可以分泌促進(jìn)新生血管形成的VEGF,還可以分泌出抑制血管生成的因子[如重組人色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)等],二者間的動(dòng)態(tài)平衡及其形成的物理屏障,可以有效地抑制脈絡(luò)膜新生血管的形成[17]。我們認(rèn)為糖尿病患者眼底視網(wǎng)膜細(xì)胞長(zhǎng)期處于缺氧狀態(tài),致色素上皮層基底部VEGF異常分泌,一系列靶基因表達(dá)上調(diào),Bruch膜受損使視網(wǎng)膜對(duì)疾病的抵御能力下降,影響各分子通路的激活,如PI3K/Akt和ERK(1/2)通路作用,使得細(xì)胞增殖新生血管形成,影響脈絡(luò)膜的供養(yǎng)能力,造成眼底光感受器細(xì)胞因缺營(yíng)養(yǎng)而死亡[18-19],破壞了色素上皮層的屏障功能。因此,Visfatin在色素上皮細(xì)胞中的表達(dá)升高提示其可能主要作用于DR視網(wǎng)膜的缺血階段,可能是局部缺血引起色素上皮細(xì)胞中Visfatin的表達(dá)增加,進(jìn)而激活VEGF的表達(dá),最終引起視網(wǎng)膜新生血管形成。我們將視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞視為重點(diǎn)研究對(duì)象,希望能夠以此為突破口,進(jìn)一步研究DR的發(fā)生機(jī)制、早期診斷與治療。圖3 Western-blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中Visfatin與VEGF蛋白表達(dá)情況。

圖2 三組視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中VEGF mRNA和Visfatin mRNA相對(duì)表達(dá)量比較表1 各組細(xì)胞中Visfatin mRNA和VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 組別 Visfatin mRNA VEGF mRNA 正常對(duì)照組 1.128±0.043a 1.601±0.058a 高糖組 1.812±0.024 2.372±0.032 干預(yù)組 1.593±0.008a 1.932±0.007a P <0.01 <0.01 注:aP<0.05 vs高糖組。

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