目的改良經(jīng)鼓室內(nèi)顯微注射慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠耳蝸的實驗技術(shù)。方法將30只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組:1μl/min組（12只）和20μl/min組（12只）小鼠經(jīng)腹側(cè)入路鼓室內(nèi)分別以1μl/min和20μl/min的速度顯微注射5μl的攜帶綠色熒光蛋白基因的慢病毒（LV3-GFP）,人工外淋巴液組（6只）以1μl/min速度注入等量外淋巴液。于手術(shù)前、術(shù)后1、3、7天各組動物行聽性腦干反應(yīng)（ABR）測試后,進(jìn)行耳蝸基底膜鋪片熒光染色和耳蝸切片免疫熒光染色,并在激光共聚焦顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染情況。結(jié)果各組小鼠術(shù)后1天ABR閾值均較術(shù)前明顯升高（P<0.01）,1μl/min組和人工外淋巴液組術(shù)后3天ABR閾值恢復(fù)正常,20μl/min組術(shù)后7天恢復(fù)正常。慢病毒轉(zhuǎn)染后,1μl/min組術(shù)后1天在耳蝸毛細(xì)胞觀察到慢病毒陽性表達(dá),術(shù)后3天在耳蝸Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)及血管紋處均可見陽性表達(dá);術(shù)后1、3、7天耳蝸中回外毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染率平均為98.3%、98.1%和98.7%,而20μl/min組術(shù)后1天未見明顯陽性表達(dá),術(shù)后1、3、7天耳蝸中回外毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率分別為4.2%、20.2%和47.... 

【文章來源】：聽力學(xué)及言語疾病雜志. 2020,28(02)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

鼓室內(nèi)顯微注射手術(shù)步驟

近年來隨著新型載體的出現(xiàn),內(nèi)耳基因治療的研究正在飛速發(fā)展。目前臨床上常用的內(nèi)耳導(dǎo)入途徑是圓窗膜途徑,如:向內(nèi)耳導(dǎo)入激素、慶大霉素等已被用于治療突發(fā)性聾以及治療梅尼埃病相關(guān)的眩暈[6]。在動物研究中,該途徑的手術(shù)方法包括鼓室內(nèi)顯微注射和圓窗膜注射法。圓窗膜注射法操作簡單,轉(zhuǎn)染效率較高,給予豚鼠圓窗膜顯微注射腺相關(guān)病毒后,耳蝸基底膜整個區(qū)域的毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染率可高達(dá)85%[7]。但由于刺破圓窗膜的損傷較大,采用此法進(jìn)行轉(zhuǎn)染的小鼠術(shù)后聽力喪失,2周后才能恢復(fù)正常[8]。而鼓室內(nèi)顯微注射法是將病毒載體滴注到完整圓窗膜上,對耳蝸損傷較小,在聽功能保護(hù)方面具有明顯優(yōu)勢。Oishi等[9]發(fā)現(xiàn),小鼠鼓室內(nèi)注射NOX3 siRNA術(shù)后第3天聽功能完全恢復(fù)正常;而經(jīng)鼓膜注射的小鼠在同一時間ABR閾值仍明顯高于正常。但是,鼓室內(nèi)注射法耳蝸轉(zhuǎn)染效率較圓窗膜注射法低,且基底膜的轉(zhuǎn)染部位分布不均,以往研究均報道底回轉(zhuǎn)染效率最高,中回和頂回則明顯降低[9,10]。圖3 1μl/min組小鼠耳蝸的轉(zhuǎn)染效果（a耳蝸鋪片熒光染色、b耳蝸切片熒光染色，×630）

圖2 實驗組耳蝸中回鋪片（熒光染色×630）為了發(fā)揮鼓室注射法聽功能損傷小的優(yōu)勢,進(jìn)一步提高耳蝸各回(尤其是中回和頂回)的病毒轉(zhuǎn)染效率,本研究從減小聽泡開窗面積和減慢液體導(dǎo)入速度兩方面,改良了內(nèi)耳基因?qū)爰夹g(shù)。本研究采用視野開闊的腹側(cè)入路進(jìn)行手術(shù),不易損傷聽骨鏈,且便于直接觀察聽泡結(jié)構(gòu);研究過程中小鼠術(shù)后全部存活,這是由于通過面神經(jīng)、二腹肌和咬肌組成的三角區(qū)標(biāo)志,精準(zhǔn)定位了手術(shù)入路,使得手術(shù)對聽泡后壁損傷較小,減少了出血風(fēng)險。使用牙鉆打孔,孔徑僅0.45 mm,并且鉆孔位置的精確定位,使得在不暴露圓窗龕的情況下完成了慢病毒載體的注射,大大減小了小鼠聽泡的開窗面積,比以往報道的開窗面積減少10倍以上[5,9,11]。小鼠鼓室內(nèi)容積約2 μl,本研究通過微量注射泵可控制液體勻速緩慢注入(1 μl/min),便于鼓室內(nèi)氣體的排出,從而最大限度地減小圓窗膜所受壓力,以減輕對小鼠的聽力損傷。本研究ABR檢測結(jié)果顯示,1 μl/min組術(shù)后3天小鼠聽力即完全恢復(fù)到正常水平,說明減小開窗和降低注入速度可以減輕鼓室內(nèi)顯微注射手術(shù)對小鼠聽力的損傷。而如果以本實驗中的耳蝸聽泡小開窗較大速度(20 μl/min)或是其他研究者報道的大開窗未控制速度(直接滴入)基因轉(zhuǎn)染載體的方式[11],小鼠聽力則需7天才能逐漸恢復(fù)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]經(jīng)圓窗膜鼓階顯微注射腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染小鼠耳蝸的研究[J]. 陳嘉偉,王衛(wèi)龍,丁雪瑞,趙倩倩,安曉剛,王人鳳,盧連軍.  聽力學(xué)及言語疾病雜志. 2019(03)
[2]9型腺相關(guān)病毒經(jīng)圓窗膜轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠耳蝸兩種方式的對比研究[J]. 齊景翠,祖勉,陳妮姍,郭維維,伊海金,楊仕明,余力生.  中華耳科學(xué)雜志. 2018(04)
[3]microRNA-146a重組慢病毒載體局部應(yīng)用治療免疫介導(dǎo)性內(nèi)耳病的實驗研究[J]. 羅晨曦,李濤,譚長強(qiáng),黃和.  醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報. 2016(08)
[4]耳前耳后注射地塞米松及慶大霉素治療梅尼埃病的療效觀察[J]. 王智勇,蘇麗娟,唐強(qiáng),禹林,蔣中莉,熊玉林,姜浩平,莫明明.  檢驗醫(yī)學(xué)與臨床. 2015(16)
[5]Lentivirus carrying the Atoh1 gene infects normal rat cochlea[J]. Song Pan,Jingzhi Wan,Shaosheng Liu,Song Zhang,Hao Xiong,Jun Zhou,Wu Xiong,Kunfei Yu,Yong Fu.  Neural Regeneration Research. 2013(17)
[6]慢病毒載體和腺病毒載體轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的比較[J]. 王國鵬,羅凌惠,謝靜,陳沛,付勇,鐘剛,龔樹生.  臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志. 2011(04)



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