目的:明確mi R-20b-5p對鼻咽癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響,并探討mi R-20b-5p靶向AEN調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞增殖及凋亡的作用機制。方法:采用q RT-PCR檢測mi R-20b-5p在鼻咽癌患者血清,鼻咽癌細(xì)胞株CNE1、HNE2、HONE1以及永生化的正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69中的表達情況;以鼻咽癌細(xì)胞CNE1、HONE1為研究對象,分別轉(zhuǎn)染NC對照、mi R-20b-5p mimics和mi R-20b-5p inhibitor上調(diào)或下調(diào)mi R-20b-5p的表達,并采用q RT-PCR檢測進行驗證細(xì)胞。平板克隆形成實驗、CCK8法、裸鼠成瘤實驗從體內(nèi)外分別分析mi R-20b-5p表達改變對細(xì)胞集落形成、細(xì)胞增殖、裸鼠成瘤的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測mi R-20b-5p mimics和mi R-20b-5p inhibitor轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞凋亡情況;采用生物信息學(xué)分析預(yù)測mi R-20b-5p下游靶基因,并采用熒光素酶報告基因檢測進行驗證;Western blot法檢測mi R-20b-5p表達改變對細(xì)胞AEN、Caspase3、Parp、Bax、Bcl-2、Bcl-xl等... 

【文章來源】：南華大學(xué)湖南省

【文章頁數(shù)】：97 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

miR-20b-5p在鼻咽癌細(xì)胞及患者樣本中表達升高（a）qRT-PCR實驗（以U6作為內(nèi)參）分析miR-20b-5p在正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69及鼻咽癌細(xì)胞

313.2miR-20b-5p在體外對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響為了進一步探究miR-20b-5p對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，我們通過上海生工合成訂購了miR-20b-5pmimics以及miR-20b-5pinhibitor，并通過在鼻咽癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染以實現(xiàn)miR-20b-5p過表達以及敲低，并進一步來觀察其對于細(xì)胞生物學(xué)行為的作用。我們在鼻咽癌細(xì)胞CNE1和HONE1中分別轉(zhuǎn)染了miR-20b-5pmimics，miR-20b-5pinhibitor以及NC對照鏈，建立過表達或敲低miR-20b-5p的瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并用實時熒光定量PCR驗證其轉(zhuǎn)染效率（圖3.2a和b），確認(rèn)其效果后再進行后續(xù)實驗。圖3.2miR-20b-5pmimics及miR-20b-5pinhibitor轉(zhuǎn)染效率驗證（a）qRT-PCR檢測miR-20b-5pmimics及miR-20b-5pinhibitor轉(zhuǎn)染效率，此為CNE1細(xì)胞系結(jié)果。（b）qRT-PCR檢測miR-20b-5pmimics及miR-20b-5pinhibitor轉(zhuǎn)染效率，此為HONE1細(xì)胞系結(jié)果。(數(shù)據(jù)均來自3次獨立重復(fù)試驗，結(jié)果均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，組間采用t檢驗�！�**”表示P＜0.01，“***”表示P＜0.001，均為與NC對照組比較的差異。）我們發(fā)現(xiàn)在臨臨樣本中miR-20b-5p的高表達與患者的腫瘤侵犯范圍較大以及較晚的臨臨分期有明顯相關(guān)。因此，我們進一步通過以下實驗分析miR-20b-5p對鼻咽癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響。通過流式細(xì)胞實驗檢測凋亡發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-20b-5pmimics組與NC對照組比較，鼻咽癌細(xì)胞的凋亡率下降，而敲低miR-20b-5p的轉(zhuǎn)染了miR-20b-5pinhibitor組，則相對于NC對照組細(xì)胞的凋亡率有明顯的增加（P<0.05）（圖3.3a）。CCK8細(xì)胞增殖試驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-20b-5pmimics的鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力較NC對照組表現(xiàn)為增強，而在瞬時轉(zhuǎn)染miR-20b-5pinhibitor敲低miR-20b-5p的細(xì)胞中，與NC對照組比較，其細(xì)胞的增殖能力則明顯減弱（圖3.3b）�？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果表明，miR-20

32此外，我們還分別對于轉(zhuǎn)染了miR-20b-5pmimics，miR-20b-5pinhibitor以及NC對照鏈的鼻咽癌細(xì)胞進行了transwell侵襲實驗,檢測miR-20b-5p對于鼻咽癌細(xì)胞侵襲的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)染了miR-20b-5pmimics以及miR-20b-5pinhibitor后與NC對照轉(zhuǎn)染組相比穿過鋪有基質(zhì)膠的小室膜的細(xì)胞數(shù)目沒有統(tǒng)計學(xué)差異（圖3.4b）。上述結(jié)果說明，miR-20b-5p對于鼻咽癌細(xì)胞的侵襲沒有作用或作用較弱，因此，我們后續(xù)實驗將重點關(guān)注miR-20b-5p對鼻咽癌增殖及凋亡的作用。圖3.3miR-20b-5p在體外對于鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響（a）在鼻咽癌CNE1，HONE1細(xì)胞系分別進行了流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染miR-20b-5pmimics，miR-20b-5pinhibitor以及NC對照鏈后細(xì)胞的凋亡情況，以及其對應(yīng)的統(tǒng)計圖。（b）CCK8實驗檢測鼻咽癌細(xì)胞CNE1，HONE1細(xì)胞增殖。（所有數(shù)據(jù)均來自3次獨立重復(fù)試驗，結(jié)果均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，組間采用t檢驗，“*”表示P＜0.05，“**”表示P＜0.01，“***”表示P＜0.001，均為與NC對照組比較的差異。）

【參考文獻】：
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本文編號：3051127