目的:明確mi R-20b-5p對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響,并探討mi R-20b-5p靶向AEN調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞增殖及凋亡的作用機(jī)制。方法:采用q RT-PCR檢測(cè)mi R-20b-5p在鼻咽癌患者血清,鼻咽癌細(xì)胞株CNE1、HNE2、HONE1以及永生化的正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69中的表達(dá)情況;以鼻咽癌細(xì)胞CNE1、HONE1為研究對(duì)象,分別轉(zhuǎn)染NC對(duì)照、mi R-20b-5p mimics和mi R-20b-5p inhibitor上調(diào)或下調(diào)mi R-20b-5p的表達(dá),并采用q RT-PCR檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證細(xì)胞。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、CCK8法、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)外分別分析mi R-20b-5p表達(dá)改變對(duì)細(xì)胞集落形成、細(xì)胞增殖、裸鼠成瘤的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)mi R-20b-5p mimics和mi R-20b-5p inhibitor轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞凋亡情況;采用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)mi R-20b-5p下游靶基因,并采用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證;Western blot法檢測(cè)mi R-20b-5p表達(dá)改變對(duì)細(xì)胞AEN、Caspase3、Parp、Bax、Bcl-2、Bcl-xl等... 

【文章來(lái)源】：南華大學(xué)湖南省

【文章頁(yè)數(shù)】：97 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

miR-20b-5p在鼻咽癌細(xì)胞及患者樣本中表達(dá)升高（a）qRT-PCR實(shí)驗(yàn)（以U6作為內(nèi)參）分析miR-20b-5p在正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69及鼻咽癌細(xì)胞

313.2miR-20b-5p在體外對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響為了進(jìn)一步探究miR-20b-5p對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，我們通過(guò)上海生工合成訂購(gòu)了miR-20b-5pmimics以及miR-20b-5pinhibitor，并通過(guò)在鼻咽癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染以實(shí)現(xiàn)miR-20b-5p過(guò)表達(dá)以及敲低，并進(jìn)一步來(lái)觀察其對(duì)于細(xì)胞生物學(xué)行為的作用。我們?cè)诒茄拾┘?xì)胞CNE1和HONE1中分別轉(zhuǎn)染了miR-20b-5pmimics，miR-20b-5pinhibitor以及NC對(duì)照鏈，建立過(guò)表達(dá)或敲低miR-20b-5p的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染效率（圖3.2a和b），確認(rèn)其效果后再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖3.2miR-20b-5pmimics及miR-20b-5pinhibitor轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證（a）qRT-PCR檢測(cè)miR-20b-5pmimics及miR-20b-5pinhibitor轉(zhuǎn)染效率，此為CNE1細(xì)胞系結(jié)果。（b）qRT-PCR檢測(cè)miR-20b-5pmimics及miR-20b-5pinhibitor轉(zhuǎn)染效率，此為HONE1細(xì)胞系結(jié)果。(數(shù)據(jù)均來(lái)自3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，組間采用t檢驗(yàn)�！�**”表示P＜0.01，“***”表示P＜0.001，均為與NC對(duì)照組比較的差異。）我們發(fā)現(xiàn)在臨臨樣本中miR-20b-5p的高表達(dá)與患者的腫瘤侵犯范圍較大以及較晚的臨臨分期有明顯相關(guān)。因此，我們進(jìn)一步通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)分析miR-20b-5p對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響。通過(guò)流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-20b-5pmimics組與NC對(duì)照組比較，鼻咽癌細(xì)胞的凋亡率下降，而敲低miR-20b-5p的轉(zhuǎn)染了miR-20b-5pinhibitor組，則相對(duì)于NC對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率有明顯的增加（P<0.05）（圖3.3a）。CCK8細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-20b-5pmimics的鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力較NC對(duì)照組表現(xiàn)為增強(qiáng)，而在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-20b-5pinhibitor敲低miR-20b-5p的細(xì)胞中，與NC對(duì)照組比較，其細(xì)胞的增殖能力則明顯減弱（圖3.3b）。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-20

32此外，我們還分別對(duì)于轉(zhuǎn)染了miR-20b-5pmimics，miR-20b-5pinhibitor以及NC對(duì)照鏈的鼻咽癌細(xì)胞進(jìn)行了transwell侵襲實(shí)驗(yàn),檢測(cè)miR-20b-5p對(duì)于鼻咽癌細(xì)胞侵襲的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)染了miR-20b-5pmimics以及miR-20b-5pinhibitor后與NC對(duì)照轉(zhuǎn)染組相比穿過(guò)鋪有基質(zhì)膠的小室膜的細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3.4b）。上述結(jié)果說(shuō)明，miR-20b-5p對(duì)于鼻咽癌細(xì)胞的侵襲沒(méi)有作用或作用較弱，因此，我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)將重點(diǎn)關(guān)注miR-20b-5p對(duì)鼻咽癌增殖及凋亡的作用。圖3.3miR-20b-5p在體外對(duì)于鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響（a）在鼻咽癌CNE1，HONE1細(xì)胞系分別進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-20b-5pmimics，miR-20b-5pinhibitor以及NC對(duì)照鏈后細(xì)胞的凋亡情況，以及其對(duì)應(yīng)的統(tǒng)計(jì)圖。（b）CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞CNE1，HONE1細(xì)胞增殖。（所有數(shù)據(jù)均來(lái)自3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，組間采用t檢驗(yàn)，“*”表示P＜0.05，“**”表示P＜0.01，“***”表示P＜0.001，均為與NC對(duì)照組比較的差異。）

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號(hào)：3051127