目的:觀察抗真菌藥物誘導(dǎo)的腸道真菌菌群失調(diào)對(duì)小鼠角膜創(chuàng)傷修復(fù)的影響。方法:選用健康無眼疾的C57BL/6J雄性小鼠,將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為兩組:對(duì)照組和兩性霉素B組。對(duì)照組給予正常飲食,兩性霉素B組給予添加兩性霉素B的飲食,以誘導(dǎo)小鼠腸道真菌菌群失調(diào),4wk后對(duì)兩組小鼠角膜進(jìn)行上皮創(chuàng)傷,使用熒光素鈉染色角膜創(chuàng)傷區(qū)域,動(dòng)態(tài)觀察上皮修復(fù)情況,并利用免疫熒光染色觀察角膜上皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞變化,通過HE染色觀察角膜厚度的變化。結(jié)果:兩性霉素B組與對(duì)照組相比,再上皮化速度和創(chuàng)傷修復(fù)延遲,炎癥細(xì)胞明顯減少,角膜上皮厚度變薄。結(jié)論:腸道真菌菌群失調(diào)延遲角膜創(chuàng)傷的修復(fù),降低角膜創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)。 

【文章來源】：國(guó)際眼科雜志. 2019,19(05)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【部分圖文】：

角膜分區(qū)模式示意圖(1區(qū)為角膜緣區(qū)，5區(qū)為角膜中央?yún)^(qū))

圖2兩組小鼠腸道真菌菌群在門、綱水平上的構(gòu)成A:門水平;B:綱水平(不同顏色表示不同菌群)。表1Alpha多樣性分析n=5組別AceChao1ShannonSimpsongoods_coverageCtrl組94.87±8.36100.71±14.675.17±0.390.92±0.011.00±0.00Amph組99.30±12.58100.50±12.754.12±0.840.93±0.021.00±0.00Z－0.52－0.31－2.41－0.730.00P0.600.750.020.471.00注:Ctrl組:對(duì)照組;Amph組:兩性霉素B組。表2兩組小鼠創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)分裂細(xì)胞計(jì)數(shù)(x珋±s，個(gè)/視野)組別0h6h12h18h24h30h36hCtrl組12.67±4.1924.17±8.6853.25±10.29112.58±25.14219.58±58.02209.92±29.42256.42±25.25Amph組7.08±2.7511.17±5.0442.58±10.2658.75±10.45141.25±28.40109.58±25.93133.92±46.83t3.864.482.546.854.208.867.98P0.001＜0.010.019＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01注:Ctrl組:對(duì)照組;Amph組:兩性霉素B組。的γδT細(xì)胞。單光子共聚焦顯微鏡斷層掃描角膜兩條直徑上第4區(qū)FITC/Gr－1標(biāo)記的嗜中性粒細(xì)胞，然后使用Imaris7.2.1軟件進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)。1.2.7角膜上皮厚度測(cè)量?jī)山M分別于創(chuàng)傷后24、48、96h各處死3只小鼠，取下完整小鼠眼球，經(jīng)固定、脫水浸蠟、包埋、切片、脫蠟等過程，制作石蠟切片并進(jìn)行HE染色，在顯微鏡10倍物鏡下拍攝圖像并使用ImageJ軟件進(jìn)行角膜厚度定量計(jì)算。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。各組數(shù)據(jù)用x珋±s表示，分裂細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、γδT細(xì)胞和角膜厚度各時(shí)間點(diǎn)組間差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。菌群多樣性和結(jié)構(gòu)分析采用秩和檢驗(yàn)Mann－WhitneyU檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1兩性霉素B誘導(dǎo)后小鼠腸道真菌菌群發(fā)生改變小鼠糞便樣本ITSrDNA測(cè)序結(jié)果顯示:兩性霉素B處理4wk后，小鼠腸道真菌菌群多

圖3兩組小鼠角膜創(chuàng)傷修復(fù)的動(dòng)態(tài)變化A:創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)熒光素鈉染色顯示創(chuàng)傷面積;B:創(chuàng)傷后各時(shí)間點(diǎn)兩組的角膜創(chuàng)傷面積占創(chuàng)傷原始面積百分比(aP＜0.05，bP＜0.01vsCtrl組)。圖4兩組小鼠創(chuàng)傷后48h角膜HE染色和上皮層厚度定量A:創(chuàng)傷后48h角膜上皮組織形態(tài)變化(×100);B:創(chuàng)傷后48h角膜上皮厚度定量計(jì)算(bP＜0.001vsCtrl組)。表3兩組小鼠創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)γδT細(xì)胞計(jì)數(shù)(x珋±s，個(gè)/視野)組別0h6h12h18h24h30h36hCtrl組105.17±13.08106.5±21.13104.67±21.91123.50±28.08196.83±44.65158±27.9662.25±14.28Amph組82.42±27.6682.75±17.8385.33±21.0699.17±24.71144.25±15.8989.08±10.8749.33±17.21t2.582.982.202.253.847.962.00P0.0210.0070.0380.0350.002＜0.010.058注:Ctrl組:對(duì)照組;Amph組:兩性霉素B組。表4兩組小鼠創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(x珋±s，個(gè)/視野)組別6h12h18h24h30h36hCtrl組87.33±28.25204.33±38.87273.83±18.74348.17±85.95273.50±52.59234.67±39.03Amph組56.50±29.28188.67±43.04223.17±44.35236.17±30.32165.33±59.45137.50±48.44t1.860.662.583.013.343.83P0.0930.5230.0380.0230.0080.003注:Ctrl組:對(duì)照組;Amph組:兩性霉素B組。2.3腸道真菌菌群失調(diào)對(duì)小鼠角膜炎癥細(xì)胞的影響通過觀察創(chuàng)傷后炎癥細(xì)胞的數(shù)量變化，說明腸道真菌菌群失調(diào)對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。兩組γδT和中性粒細(xì)胞數(shù)量在創(chuàng)傷后均明顯增加，但是與Ctrl組相比，Amph組角膜兩條徑線上γδT細(xì)胞數(shù)量顯著下降(表3)，中性粒細(xì)胞數(shù)量也明顯降低(表4)。結(jié)果表明，腸道真菌菌群失調(diào)小鼠創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)降低，炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯減少。2.4腸道真菌菌群失調(diào)對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)后角膜厚度的影響Amph組小鼠角膜創(chuàng)傷后上皮厚?


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