發(fā)布時間：2017-04-09 08:04

  本文關鍵詞：探討熊果酸對大鼠同種異體角膜移植排斥反應的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：角膜移植術后免疫排斥反應是由多種免疫細胞和免疫分子共同參與的復雜的免疫反應過程。雖然角膜自身具有前房相關性免疫偏離與免疫赦免的特點,但移植術后的排斥反應仍是造成角膜移植失敗的主要原因。長期以來,防治免疫排斥反應成為研究角膜移植的重要方向。目前臨床上普遍采用的非特異性免疫抑制療法,只是“治標”的方法,療效有限且毒副作用大。近年來,應用某些藥物可以更有效抑制角膜移植排斥反應的發(fā)生,從而延長角膜植片的存活時間,成為研究角膜移植術后排斥反應的方向之一。研究背景熊果酸,又名烏索酸、烏蘇酸、α-香樹脂醇,是一種弱酸性五環(huán)三萜類化合物,能夠從多種天然植物提取的功能成分。純品一般為白色針狀結晶(乙醇中結晶),味略微苦,基本骨架是由多氧蒎的五環(huán)母核所構成的�；瘜W名3-Hydroxy-12-ursen-28-oic acid,分子式C30H11803,相對分子質(zhì)量456.68,熔點285-291℃,可溶于甲醇、乙醇、丁醇、丁酮,略溶于丙酮,微溶于苯、氯仿、乙醚,易溶于二氧六環(huán)、吡啶,不溶于水和石油醚。熊果酸不僅僅對多種惡性腫瘤的增殖具有明顯的細胞毒作用,而且能夠誘導細胞分化及抑制新生血管的形成,還對多種致癌促癌物質(zhì)造成的細胞癌變具有抵抗作用。另一方面,能夠抑制腫瘤細胞增殖和血管內(nèi)皮細胞形成,有抗菌、抗糖尿病、抗新生血管、抗?jié)�、降低血脂、抗組織氧化及增強機體免疫功能等多種生物學作用和藥理活性。在角膜移植術后的免疫排斥反應過程中,主要是由CD4Th1細胞起作用的。核因子NF-κB是一種能與免疫球蛋白k輕鏈基因的增強子KB序列特異結合的蛋白因子,是在B細胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn),不僅能夠大量存在于真核細胞內(nèi),而且能夠與多種細胞基因的啟動子序列或增強子序列的特定位點發(fā)生特異性結合,從而促進其轉(zhuǎn)錄和表達。另外,NF-κB在炎癥、腫瘤、過敏反應等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的作用,能夠與細胞的增生、轉(zhuǎn)化和凋亡,以及炎癥、免疫應答反應等重要的病理生理過程緊密聯(lián)系。NF-κB可上調(diào)T細胞表面B7共刺激分子與MHC-Ⅱ勺表達,刺激Thl細胞因子IL-2與IFN-γ的產(chǎn)生。熊果酸抑制NF-κB的活性,從而下調(diào)IL-2、IFN-γ分子的表達情況,延長移植物存活時間。熊果酸是通過PKC-lκ-Bα-NF-κB信號通路介導免疫抑制的,抑制IK-Ba磷酸化和核因子NF-KBp65核轉(zhuǎn)錄,導致由PKC磷酸化的NF-κB活化抑制。NF-κB是炎癥和免疫反應過程中重要的調(diào)節(jié)因子,能夠調(diào)節(jié)T細胞活化、增殖與基因轉(zhuǎn)錄。由p50、p65兩個異質(zhì)二聚體構成,與抑制亞基單位Iκ-Bα結合,存在于未活化狀態(tài)的胞液中。通過Iκ-B激酶,使抑制亞基單位κ-Bα的絲氨酸32、36部位磷酸化,磷酸化的作用在于泛素化與降解。Iκ-Bα降解可導致活化單位的p50、p65的釋放并結合到細胞核,結合到特定的啟動子區(qū)域,編碼炎癥細胞因子。另外,熊果酸可明顯抑制新生血管的生成,減輕免疫排斥的炎癥反應；降低由CD3/CD8誘導的T細胞表面標志CD25、CD69與IL-2的表達含量,抑制NF-κB核因子轉(zhuǎn)錄與T細胞活性,而非通過上調(diào)CD4 CD25 Foxp3T細胞,誘導宿主的特異性免疫耐受；能夠抑制B細胞、T細胞、巨噬細胞的活化,增殖與細胞因子的分泌。抑制絲裂霉素誘導的ERK、JNK的磷酸化與免疫調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、 NF-AT與AP-1的活化,明顯降低IL-2、IL-4、IL-6及IL-17的含量,降低T細胞表面CD25、CD69、CD134、CD80及CD86的含量；呈劑量依賴性地抑制T細胞的活化與增殖,能夠明顯降低T細胞表面活性標志CD25、CD69與CD71的含量,降低NF-κB的表達,從而抑制T細胞活性。因此,本實驗擬應用“熊果酸抑制NF-κB的活性,延長角膜移植存活時間”方案,經(jīng)腹腔內(nèi)注射至同種異體大鼠角膜移植模型(SD→Wistar)的受體體內(nèi),探討熊果酸對誘導角膜移植免疫耐受的影響,為臨床進行有效治療、抑制角膜移植術后的排斥反應提供重要的理論依據(jù)。材料與方法1、實驗動物供體為SD大鼠；受體為Wistar大鼠。鼠齡6-8周,體重180-220g,雌性。分4組：A：空白對照組(n=8)；B：自體角膜移植組(n=8)；C：同種異體角膜移植組；D：熊果酸組(n=8),建立大鼠同種異體角膜移植模型,術后觀察角膜移植排斥反應及按Larkin等人評分標準評分,術后14天取材。2、病理組織切片HE染色術后第14天,分別于各組中取大鼠角膜植片進行組織病理學檢測,標本經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定、脫水、常規(guī)石蠟包埋,制備成5μm厚的連續(xù)切片,經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色,顯微鏡下觀察角膜植片病理學變化。3、Real Time PCR (RT-PCR)檢測取大鼠角膜,置于1mL Trizol的離心管中,采用Trizol一步法提取總RNA,行瓊脂糖凝膠電泳檢測；以焦碳酸二乙酯(DEPC)水為空白對照,應用Nanodrop測定RNA濃度,同時記錄各組的RNA濃度及其OD260/OD280值；按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書,逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA。提取的DNA樣品直接用于qPCR實驗或者-20℃保存。引物序列為：GAPDH上游：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'下游：5'-TCCACCACCCT GTTGCTGAT-3'IL-2上游：5'-TGATGGACCTACAGGAGCTCCTGAG-3'下游：5'-GAGTCAAATCCAGAACATGCCGCAG-3'VEGF上游:5'-GGCCTCTGAAACCATGAACT-3'下游：5'-TGAACTTCACCACTTGGCAT-3'IFN-γ上游:5'-GGAGGAACTGGCAAAAGGATGGT-3'下游：5'-TTGGGACAATCTCTTCCCCAC-3'ICAM-1上游：5'-GCTACATCCACACTGACGCT-3'下游：5'-CAGGGAATGAGTAGACCTCCA-3'NF-KBp65上游：5'-CCGTGGAGTACGACAACATC-3'下游：5'-CCTCTTCCAGCTGCTATGTG-3'RT-PCR反應體系如下：反應總體積(Total)為20μl:SYBR@ (R) PrimxEx Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus) (2x) 10.0μl, PCR Forward Prime (10μM) 0.8μl、PCR Reverse orword Prime (10μM) 0.8μl、ROX reference Dye (50x)、DNA模板2μ1、dH2O(滅菌蒸餾水)6μ1。反應條件：95℃30s預變性,95℃5s,60℃34s,40個循環(huán),重復3次。4、Western Blotting檢測取大鼠角膜植片,采用冰凍的RIPA裂解液裂解角膜組織,PBS緩沖液進行洗滌,加入蛋白酶抑制劑,提取核蛋白；SDS-PAGE凝膠電泳進行蛋白分離,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；室溫下用封閉液(5%脫脂奶)封閉1h；兔抗NF-κBp65多克隆抗體、兔抗IκB-α多克隆抗體(1：4000),鼠抗ICAM-1單克隆抗體4℃孵育過夜；洗滌與封閉后,與相應的Ⅱ抗(1：10000)結合,定影、顯影、曝光,化學發(fā)光法顯示免疫條帶。GAPDH作為內(nèi)參抗體。采用凝膠成像分析系統(tǒng)對條帶進行定量分析。5、統(tǒng)計學分析方法應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件,對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理。應用Kaplan-Meier檢驗比較各組植片的平均存活時間。實驗數(shù)據(jù)采用x±s表示,所有數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗后,采用單因素方差分析及兩樣本均數(shù)比較的t檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果1.與同種異體角膜移植組相比,熊果酸組的角膜植片存活時間明顯延長,P0.05,兩組間的差異有統(tǒng)計學意義。2.各組(正常對照組、自體角膜移植組、同種異體角膜移植組及熊果酸組)取眼球組織行病理組織切片檢查,結果顯示：正常角膜組織結果清楚,未見異常；自體角膜移植組中角膜各層結構清楚,未見明顯異常,僅基質(zhì)層中見少量新生血管與炎性細胞浸潤；同種異體角膜移植組角膜各層組織中大量單核巨噬細胞及淋巴細胞浸潤,基質(zhì)層可見新生血管形成,部分新生血管的管腔中亦可見散在的少量淋巴細胞；熊果酸組的角膜結構基本保持正常,植片基質(zhì)層僅有個別淋巴細胞浸潤,植床處可見少量新生血管。3.各組(正常對照組、自體角膜移植組、同種異體角膜移植組及熊果酸組)取角膜移植片行RT-PCR檢測,各組角膜植片中NF-KBp65, IL-2, VEGF, IFN-y, ICAM-1的相對含量(RQ值表示)在mRNA水平上有差異,B組、C組在角膜移植術后,IL-2, IFN-γ, NF-κBp65, VEGF, ICAM-1的含量會明顯升高,D組,即熊果酸組,用藥之后,相應的炎癥指標明顯下降。應用單因素方差分析,先進行方差齊性檢驗,F值依次為236.991,414.224,24.931,32.164,21.383,采用LSD檢驗進行兩兩比較,正常組與自體角膜移植組之間的差異無統(tǒng)計學意義；C組與D組之間,NF-κBp65的相對含量差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),其余各組之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。4.各組(正常對照組、自體角膜移植組、同種異體角膜移植組及熊果酸組)取角膜移植片行Western Blotting檢測,各組角膜植片中NF-κBp65,IκB-α的相對含量(用1A表示)在蛋白表達水平上有所差異,自體角膜移植組、熊果酸組在角膜移植術后,NF-κBp65,κB-α的相對含量變化趨勢一致；與同種異體角膜移植組相比,熊果酸組NF-κBp65的相對含量明顯下降,而κB-α的含量升高。結論1.同種異體大鼠角膜移植術后,熊果酸組角膜植片的存活時間明顯延長；病理組織切片顯示：熊果酸組的淋巴細胞浸潤與新生血管情況,均較同種異體角膜移植組明顯好轉(zhuǎn)；說明熊果酸對移植術后排斥反應具有一定的抑制作用。2.RT-PCR檢測結果顯示：在mRNA水平上,各組角膜植片中IL-2、IFN-γ、 NF-κBp65、VEGF、ICAM-1的相對含量有差異,用藥之后,相應的炎癥指標明顯下降；Western Blotting檢測結果表明,熊果酸組NF-KBp65的相對含量明顯下降,而κ-Bα的含量升高,熊果酸可能通過抑制NF-κB通道蛋白的表達,抑制角膜移植排斥反應的。因此,本實驗為熊果酸的臨床應用提供實驗依據(jù)。
【關鍵詞】：大鼠 角膜移植 穿透性 熊果酸 排斥反應
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R779.65
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-23
• 第一部分 大鼠同種異體角膜動物模型建立及術后排斥反應情況的觀察23-34
• 1. 材料24-25
• 1.1 實驗動物24
• 1.2 主要試劑24
• 1.3 主要儀器及器械24-25
• 2. 方法25-27
• 2.1 排斥反應的評分標準25-26
• 2.2 術后排斥反應的觀察26-27
• 3. 結果27-30
• 4. 討論30-34
• 第二部分 大鼠角膜植片組織病理學檢查、熒光定量PCR檢測與WESTERN BLOTTING檢測及結果分析34-53
• 1. 材料34-35
• 1.1 實驗對象34
• 1.2 主要試劑34
• 1.3 主要儀器34-35
• 2. 方法35-42
• 2.1 組織病理學35-36
• 2.2 熒光定量PCR36-37
• 2.3 Western Blotting檢測37-42
• 2.4 統(tǒng)計學方法42
• 3. 結果42-47
• 3.1 組織病理學結果42-43
• 3.2 RT-PCR檢測結果43-45
• 3.3 Western-Blotting檢測45-47
• 4. 討論47-53
• 4.1 IL-2與角膜移植排斥反應的關系48-49
• 4.2 IFN-γ與角膜移植排斥反應的關系49
• 4.3 核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與角膜移植排斥反應的關系49-50
• 4.4 VEGF與角膜移植排斥反應的關系50-51
• 4.5 ICAM-1與角膜移植排斥反應的關系51-52
• 4.6 熊果酸與角膜移植排斥反應的關系52-53
• 參考文獻53-60
• 全文小結60-61
• 綜述61-69
• 參考文獻66-69
• 縮寫詞中英文對照表69-70
• 研究成果70-71
• 致謝71-72

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王博;吳京;馬明;李萍萍;于健;;熊果酸對大鼠角膜移植排斥反應的抑制作用[J];南方醫(yī)科大學學報;2015年04期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王海鷹;靈芝多糖通過TLR信號通路對糖尿病角質(zhì)形成細胞的影響[D];復旦大學;2013年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 方琨;弓形蟲C-18、MIC11、PI等體內(nèi)外差異表達基因?qū)F-κB信號通路的影響[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2014年

2 唐媛媛;弓形蟲Chinese1基因型蟲株誘導巨噬細胞偏移應答的研究[D];安徽醫(yī)科大學;2014年

3 周琨;CCR7基因修飾未成熟樹突狀細胞誘導大鼠高危角膜移植免疫耐受的研究[D];石河子大學;2014年

  本文關鍵詞：探討熊果酸對大鼠同種異體角膜移植排斥反應的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：294789