背景白內(nèi)障是導(dǎo)致失明的主要原因。UV照射、代謝異常、基因突變、老化等因素能導(dǎo)致眼睛中的晶狀體代謝紊亂,晶狀體混濁,這些是白內(nèi)障的主要發(fā)病原因。哺乳動(dòng)物眼睛中的晶狀體是透明的結(jié)構(gòu),由兩種細(xì)胞組成,上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞。上皮細(xì)胞主要排列在晶狀體前半球,由單層細(xì)胞組成,具有終身增殖與分化的能力。其余部分是由終末分化的纖維細(xì)胞組成,主要維持晶狀體的內(nèi)部穩(wěn)定及透明度。在哺乳動(dòng)物的晶狀體中,上皮細(xì)胞會(huì)經(jīng)過(guò)細(xì)胞周期停滯、伸長(zhǎng)并分化成晶狀體纖維細(xì)胞。晶狀體上皮對(duì)維持晶狀體纖維的穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用,影響晶狀體的生長(zhǎng),分化與穩(wěn)態(tài)。老年性白內(nèi)障是白內(nèi)障中最常見(jiàn)的類(lèi)型,主要表現(xiàn)為晶狀體渾濁,晶狀體上皮細(xì)胞的衰老會(huì)使細(xì)胞增殖受抑制,細(xì)胞周期阻滯,導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生。熱休克因子（HSF）是介導(dǎo)熱休克反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子,主要是轉(zhuǎn)錄調(diào)控?zé)嵝菘说鞍祝℉sps）的表達(dá)。熱休克蛋白作為分子伴侶保護(hù)細(xì)胞免受蛋白毒性等損傷。在熱休克或在某些壓力條件下,熱休克因子結(jié)合熱休克蛋白（HSPs）基因啟動(dòng)子上的熱休克元件（HSE）,激活熱休克蛋白基因的轉(zhuǎn)錄。哺乳動(dòng)物中熱休克因子至少由三個(gè)成員組成,Hsf1、Hsf2和Hsf4。Hsf4屬... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

敲除Hsf4的斑馬魚(yú)眼睛內(nèi)出現(xiàn)明顯的白內(nèi)障

圖 2.2 敲除 Hsf4 斑馬魚(yú)的晶狀體具有衰老相關(guān)表型。（A）用解剖鑷將 12 個(gè)月的的斑馬魚(yú)的晶狀體從眼睛中剝離，用 500 μl 的 β-Gal 染色固定液固定 15 min，按孵育 1-2 h，在體式顯微鏡下觀察晶狀體著色情況。（B）將 12 個(gè)月的 Hsf4 mutant 用 100 μl 的 β-Gal 染色固定液固定 15 min，按說(shuō)明書(shū)配制染色液孵育 1-2 h，在體狀體上皮細(xì)胞著色情況。（C）取 WT、Hsf4 mutant 的成年斑馬魚(yú)的晶狀體， Triz組織中的 RNA，通過(guò) qRT-PCR 檢測(cè)衰老相關(guān)的分泌因子 zIL1b、zIL15、zIF、zIL7az-CXCL12 的表達(dá)量。zβ-actin 為內(nèi)參。2.3 在小鼠晶狀體上皮細(xì)胞中敲除 Hsf4，導(dǎo)致不依賴(lài)表達(dá)量上升在小鼠晶狀體上皮細(xì)胞中，利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)在 Hsf4 基因的GFP 標(biāo)簽，敲除 Hsf4 基因。最終篩選出 3 株敲除 Hsf4 的細(xì)胞株，在前敲除細(xì)胞系中出現(xiàn)衰老的表型，如 β-半乳糖甘酶活性增高、衰老相關(guān)異染

許多刺激反應(yīng)的重要介質(zhì)[22]，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激后，抑癌基因 p531 是 p53 的下游靶基因，p21 對(duì) G1 期 CDK 起抑制作用，使細(xì)胞周期阻以我們猜想是否在敲除 Hsf4 小鼠晶狀體上皮細(xì)胞中，引起 p21 表達(dá)p53-p21-RB 這條通路。首先我們鋪兩組野生型 mLEC 和敲除 Hsf4 的組細(xì)胞直接用正常培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h，另一組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng) 12 h再恢復(fù) 12 h，收取細(xì)胞，用 NP40 裂解 30min，取上清液。免疫印跡p53、p-p53、GFP 的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 ctrl 的一組細(xì)胞中，與野生除 Hsf4 細(xì)胞系中 p21 的表達(dá)量上升（圖 2.3 第 2.3.4 泳道），用 10JU上升更明顯（圖 2.3 第 6.7.8 泳道）。無(wú)論是否用 10JUV 處理，與野敲除 Hsf4 細(xì)胞系中 p-p53/S15、p53 的表達(dá)量幾乎不變（圖 2.3），在中 GFP 蛋白均表達(dá)出來(lái)（圖 2.3）。因此在晶狀體上皮細(xì)胞中敲除 H3 未發(fā)生磷酸化，p21 的誘導(dǎo)不依賴(lài)于 p53 這條通路。


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