發(fā)布時(shí)間：2020-10-22 13:55

　　 氧化應(yīng)激過程中積累大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成破壞,繼而導(dǎo)致細(xì)胞變性。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞是位于視網(wǎng)膜感光細(xì)胞和脈絡(luò)膜血管之間的單層色素上皮細(xì)胞。RPE的主要生理功能之一是吞噬和降解脫落的感光細(xì)胞外節(jié)盤,這一過程易造成細(xì)胞內(nèi)ROS的大量積累。已有研究揭示,氧化應(yīng)激能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)引起RPE細(xì)胞變性,是年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)這一主要致盲眼病的主要由誘因。白介素17(Interleukin-17,IL17)是一條關(guān)鍵的促進(jìn)炎癥信號(hào)通路。以往研究表明,IL17的受體IL17RC在AMD病人中高表達(dá),并且IL17信號(hào)通路的激活促進(jìn)RPE損傷和AMD發(fā)生。然而,IL17信號(hào)通路在氧化應(yīng)激中的調(diào)控機(jī)制目前未知。本文通過葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GO)處理RPE人永生化細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19,碘酸鈉腹腔注射小鼠,構(gòu)建體內(nèi)、體外RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激模型,對(duì)氧化應(yīng)激在RPE細(xì)胞中如何促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)行了初步研究。經(jīng)過實(shí)驗(yàn),我們得出以下結(jié)論:(1)IL17RA在氧化應(yīng)激的RPE細(xì)胞中表達(dá)上調(diào);(2)IL17RA在氧化應(yīng)激的RPE細(xì)胞中上調(diào)下游促炎細(xì)胞因子;(3)IL17RA啟動(dòng)子在氧化應(yīng)激的RPE細(xì)胞中與轉(zhuǎn)錄因子KLF4的結(jié)合增強(qiáng);(4)氧化應(yīng)激的RPE細(xì)胞KLF4蛋白表達(dá)上調(diào)。本文初步揭示了在RPE細(xì)胞中氧化應(yīng)激促進(jìn)炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制,證實(shí)在氧化應(yīng)激條件下RPE細(xì)胞中KLF4對(duì)IL17RA的激活作用,為RPE細(xì)胞變性相關(guān)的眼病例如AMD的治療,提供了參考數(shù)據(jù)。
【學(xué)位單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R774.5
【部分圖文】：

第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.體外氧化應(yīng)激模型中 RPE 細(xì)胞 IL17RA 表達(dá)量升高為研究RPE細(xì)胞中氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)炎癥反應(yīng)的影響，本文利用永生化的細(xì)胞系 ARPE-19 以及 RPE1 細(xì)胞構(gòu)建了體外氧化應(yīng)激模型。常用的體外氧化激模型通常使用過氧化氫（H2O2）加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，由于向培養(yǎng)細(xì)單次加入 H2O2會(huì)迅速釋放殆盡，而葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，GO）能在氧條件下，特異性催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸以及 H2O2。本文采用向無血培養(yǎng)基中加入 GO，能夠在藥物處理過程中穩(wěn)定釋放 H2O2，以此構(gòu)建 RPE 細(xì)體外氧化應(yīng)激模型。本文為探究氧化應(yīng)激條件下 RPE 細(xì)胞 IL17RA 蛋白水平的變化，以 AR細(xì)胞和 RPE1 細(xì)胞為材料，設(shè)計(jì)了 GO 處理的藥物濃度梯度以及處理時(shí)間梯度驗(yàn)。以不同濃度的 GO 無血清培養(yǎng)基處理細(xì)胞 3 h，10 mU/ml 的 GO 無血清培基處理細(xì)胞不同的時(shí)長(zhǎng)。收取細(xì)胞提蛋白，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法（western blotWB）實(shí)驗(yàn)，結(jié)果分別見圖 1-1 及圖 1-2。

分析圖1-2所示W(wǎng)B結(jié)果，RPE1細(xì)胞在經(jīng)受GO處理后，與未經(jīng)處理的RPE1細(xì)胞相較，IL17RA 條帶所示信號(hào)同樣出現(xiàn)清晰可見的增強(qiáng)。結(jié)合條帶灰度分析所得柱狀圖，經(jīng) GO 處理的 RPE1 細(xì)胞表達(dá)了更多的 IL17RA 蛋白。并且，呈現(xiàn)出與 ARPE 細(xì)胞相似的處理時(shí)間依賴性與劑量依賴性。由此可以證實(shí)，在氧化應(yīng)激條件下，RPE1 細(xì)胞中的 IL17RA 在蛋白水平的表達(dá)顯著增加。根據(jù)兩種 RPE 細(xì)胞 GO 處理的 WB 結(jié)果，表明 RPE 細(xì)胞經(jīng)不同濃度和不同時(shí)間的 GO 處理，IL17RA 在蛋白水平的表達(dá)均升高。為了求證在氧化應(yīng)激條件下的 RPE 細(xì)胞中，IL17RA 轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)是否發(fā)生變化。使用 10 mU/ml 濃度的 GO 無血清培養(yǎng)基處理 ARPE-19 以及 RPE1 細(xì)胞，F(xiàn)ig.1-2 WB analysis expression of IL17RAproteins treat by GO in RPE1 cells.設(shè)置 GO 濃度梯度：0、10 mU/ml、50 mU/ml 和 100 mU/ml，分別處理 RPE1 細(xì)胞 3 h。設(shè)置處理時(shí)間梯度：0 h、1 h、2 h 和 3 h，用 10 mU/ml GO 分別處理 RPE1 細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間。提取蛋白，進(jìn)行 Western Blot，檢測(cè) IL17RA 的表達(dá)，灰度分析條帶并制成柱狀圖。ARPE cells were treated with GO from 0-100 mU/ml or 0-3 hour as indicated. Fordose-dependent experiments, the treatment time was 3 h. For time-dependence experiment,thetreatment concentration was 10mU/ml. Right panelsshow the quantification of the relative levelof IL17RA protein based on the left immunoblot.

-3 的 qPCR 結(jié)果顯示，對(duì)比未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組（Control，在 GO 處理造成氧化應(yīng)激（OS）的 ARPE-19 及 RPE1 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)對(duì)照組的 2-3 倍。qPCR 的結(jié)果證實(shí)，在氧化應(yīng)激條件下 RPE 細(xì)的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)顯著上升。圖 1-1、圖 1-2 和圖 1-3 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在 RPE 細(xì)胞的體外氧IL17RA 在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平的表達(dá)均有顯著升高。化應(yīng)激模型中 RPE 細(xì)胞 IL17RA 表達(dá)量升高已通過體外試驗(yàn)，證實(shí)在 RPE 細(xì)胞中氧化應(yīng)激引起 IL17RA 表構(gòu)建體外氧化應(yīng)激模型，以確定體內(nèi)RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激是否改變本文所在實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表論文中，已有利用碘酸鈉（NaIO3，SI）建體內(nèi)氧化應(yīng)激模型[28]，而 NaIO3是一種主要靶向 RPE 細(xì)胞的。本文依舊采用 NaIO3作為注射藥物，考慮到眼窩注射對(duì)操作者圖 1-3 qRT-PCR 檢測(cè)氧化應(yīng)激下 RPE 細(xì)胞中 IL17RA 的轉(zhuǎn)錄活性-3 qRT-PCR analysis to detection IL17RAexpression with GO treatment (10 n ARPE and RPE1 cells.
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