目的：觀察玻璃體切除術(shù)后微環(huán)境的改變對兔晶狀體上皮細胞線粒體活性氧、膜電位、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及Caspases-3表達的影響及茶多酚眼用凝膠干預(yù)后的變化，研究玻璃體腔微環(huán)境的改變對兔晶狀體上皮細胞的影響及茶多酚眼用凝膠的干預(yù)作用，闡明玻璃體切除術(shù)后并發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)病機制及茶多酚眼用凝膠的效果。 方法：1.體外培養(yǎng)兔晶狀體上皮細胞(Rabbit lens epithelial cells，RLECs)，分別采用BSS、硅油、O_2、C_3F_8制成特殊用途選擇培養(yǎng)基，模擬體內(nèi)玻璃體切除術(shù)后條件，加入不同濃度的茶多酚眼用凝膠進行干預(yù)，觀察玻璃體腔微環(huán)境的改變對兔晶狀體上皮細胞形態(tài)的變化。2.配制含終濃度分別為1000μg/ml、100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0μg/ml茶多酚眼用凝膠的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)兔晶狀體上皮細胞，通過CCK-8法篩選出適合細胞生長的茶多酚眼用凝膠的安全濃度。3.實驗分為四組：A組(正常RLECs)-正常組，B組(RLECs+BSS、硅油、O_2、C_3F_8)-對照組，C組(RLECs+BSS、硅油、O_2、C_3F_8+10μg/ml茶多酚眼用凝膠)，D組(RLECs+BSS、硅油、O_2、C_3F_8+100μg/ml茶多酚眼用凝膠)。4.通過流式細胞儀檢測線粒體活性氧、膜電位的情況，免疫熒光化學(xué)檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的表達情況及免疫組化檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspases-3蛋白表達變化，進而研究玻璃體切除術(shù)后并發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)病機制及茶多酚眼用凝膠的效果。 結(jié)果：1.倒置相差顯微鏡下見：體外培養(yǎng)的兔晶狀體上皮細胞呈梭形或多邊形，單層貼壁生長，細胞邊界清楚。2. CCK-8法檢測顯示：(1)加入終濃度為1000μg/ml的茶多酚眼用凝膠組OD值明顯低于單純晶狀體上皮細胞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；(2)加入終濃度分別為100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml的茶多酚眼用凝膠組與單純晶狀體上皮細胞組OD值未見明顯差異，無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.在BSS、硅油、O_2、C_3F_8損傷模型建立后，倒置相差顯微鏡下觀察A~D組細胞見：A組細胞呈梭形或多邊形，單層貼壁生長，細胞邊界清楚。B組一些細胞體積縮小、變圓，折光性改變，細胞周圍見透亮圈；細胞核縮小，分裂為多個或出現(xiàn)核邊聚；培養(yǎng)液中出現(xiàn)圓形懸浮細胞及細胞碎片。C~D組細胞呈梭形或多邊形，單層貼壁生長，細胞邊界清楚，少許細胞體積縮小、變圓，折光性改變，培養(yǎng)液中未出現(xiàn)圓形懸浮細胞及細胞碎片。4.在BSS、硅油、O_2、C_3F_8培養(yǎng)條件下的上皮細胞線粒體活性氧產(chǎn)生增多，而應(yīng)用茶多酚眼用凝膠干預(yù)組活性氧的產(chǎn)生明顯減少。5.在BSS、硅油、O_2、C_3F_8培養(yǎng)條件下的上皮細胞線粒體膜電位降低；而茶多酚眼用凝膠干預(yù)組細胞線粒體膜電位升高。6.經(jīng)免疫熒光檢測，在BSS、硅油、O_2、C_3F_8培養(yǎng)條件下晶狀體上皮細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的陽性率明顯降低，而應(yīng)用茶多酚眼用凝膠干預(yù)后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的陽性率明顯升高。7.經(jīng)免疫組化檢測，在BSS、硅油、O_2、C_3F_8培養(yǎng)條件下晶狀體上皮細胞中Caspases-3表達明顯，而應(yīng)用茶多酚眼用凝膠干預(yù)后Caspases-3表達明顯降低。 結(jié)論：玻璃體切除術(shù)后微環(huán)境的改變引發(fā)晶狀體上皮細胞的凋亡，上皮細胞的凋亡是玻切術(shù)后并發(fā)性白內(nèi)障發(fā)生的原因之一，而茶多酚眼用凝膠能夠有效抑制上皮細胞線粒體活性氧水平，保護線粒體膜電位及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，降低細胞凋亡過程中最重要的終末執(zhí)行酶Caspases-3表達水平，從而抑制晶狀體上皮細胞凋亡。保護晶狀體上皮細胞免受損害，維持其結(jié)構(gòu)和功能的正常，從而可能延緩玻切術(shù)后并發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生。
【學(xué)位單位】：山東中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R779.6
【部分圖文】：

培養(yǎng)6d的RLECs (100×) 培養(yǎng)8d的RLECs (100×)培養(yǎng)10d的RLECs (100×) 培養(yǎng)14d的RLECs (100×)圖1-1 原代培養(yǎng)兔晶狀體上皮細胞的生長過程1.4.2 兔晶狀體上皮細胞的傳代培養(yǎng)原代兔晶狀體上皮細胞生長周期較長，在10~14d時可達到80%匯合狀態(tài)，可用作進一步實驗。傳代后1w左右可再次傳代，傳至第5代時細胞開始發(fā)生轉(zhuǎn)化變?yōu)槌衫w維細胞，呈梭形或見偽足向外伸展，此時不可作進一步實驗。見圖1-2

6傳2代RLECs (200×) 傳5代RLECs (200×)圖1-2 傳代兔晶狀體上皮細胞生長過程1.4.3 CCK-8法檢測不同濃度茶多酚眼用凝膠對兔晶狀體上皮細胞活性的影響顯示：第1組OD值明顯低于其他組，統(tǒng)計學(xué)具有顯著差異，P<0.05。見表1-1表1-1 不同濃度茶多酚眼用凝膠對RLECs活性的影響GROUP N OD 值第1組 5 0.031±0.0069*第2組 5 0.058±0.0137第3組 5 0.064±0.0077第4組 5 0.069±0.0077第5組 5 0.076±0.0093*表示與其他組比較P<0.051.5 討論并發(fā)性白內(nèi)障是玻璃體切除術(shù)后的一種常見并發(fā)癥，晶狀體上皮細胞是其主要靶位。通過體外培養(yǎng)兔晶狀體上皮細胞，改變培養(yǎng)條件，模擬體內(nèi)玻璃體腔微環(huán)境改變的特點，是研究玻切術(shù)后并發(fā)性白內(nèi)障重要而有效的手段。在無菌條件下分離出晶狀體前囊膜，經(jīng)適當(dāng)處理后置于合適的條件進行培養(yǎng)，是晶狀體上皮細胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。晶狀體上皮細胞體外培養(yǎng)為克隆樣貼附型生長，細胞形態(tài)為扁平的多角形，其生長特點為細胞之間緊密相靠、互相銜接，呈“鋪路石”狀，細胞多為單層，且存在接觸抑制和密度抑制現(xiàn)象。晶狀體的組織結(jié)構(gòu)可分為：晶狀體囊、晶狀體前囊上皮細胞、結(jié)合質(zhì)、晶狀體纖維、晶狀體懸韌帶[1]。晶狀體是一個獨特的器官

細胞變得稀疏。見圖2-1BSS培養(yǎng)4d的RLECs (200×) 硅油培養(yǎng)4d的RLECs (200×)O2培養(yǎng)4d的RLECs (200×) C3F8培養(yǎng)4d的RLECs (200×)圖2-1 BSS、硅油、O2、C3F8培養(yǎng)基中的兔晶狀體上皮細胞1.2.2 不同濃度茶多酚眼用凝膠對BSS、硅油、O2、C3F8培養(yǎng)的兔晶狀體上皮細胞干預(yù)的影響B(tài)SS、硅油、O2、C3F8培養(yǎng)的兔晶狀體上皮細胞，在含終濃度分別為10μg/ml、100μg/ml的茶多酚眼用凝膠培養(yǎng)基中，上皮細胞較好的保持了原有的細胞形態(tài)，細胞之間緊密相靠，互相銜接，排列規(guī)則，較少出現(xiàn)細胞腫脹、空泡和顆粒等，細胞未見稀疏。見圖2-2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 汪榮軍;;左氧氟沙星眼用凝膠的制備[J];安徽醫(yī)藥;2006年02期

2 刁雨輝;周建平;胡雄林;;眼用溫敏凝膠釋放度及其影響因素研究[J];廣東藥學(xué)院學(xué)報;2008年06期

3 楊潔,高飛;活性氧與細胞凋亡的研究進展[J];國外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊);2002年04期

4 郭炎榮;;眼用凝膠劑臨床應(yīng)用概述[J];海峽藥學(xué);2008年04期

5 金甌;郁引飛;;左氧氟沙星地塞米松眼用凝膠的制備及質(zhì)量控制[J];海峽藥學(xué);2010年07期

6 孟祥云;;中藥凝膠劑的研究概況[J];黑龍江醫(yī)藥;2007年01期

7 龔楚良;黃志元;;復(fù)方熊膽眼用即型凝膠的制備和質(zhì)量控制[J];江西中醫(yī)藥;2009年07期

8 張俊明;李良;鄭國安;郭晟;丁琦;;復(fù)方熊膽眼用即型凝膠局部眼刺激性試驗[J];內(nèi)蒙古中醫(yī)藥;2009年23期

9 代龍;;珍珠明目眼用即型凝膠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J];齊魯藥事;2008年12期

10 徐亞靜;胡容峰;尹輝;高宇;;加替沙星pH敏感眼用原位凝膠體外釋放的研究[J];中國生化藥物雜志;2010年02期

本文編號：2828886