研究背景和目的下咽鱗狀細胞癌(HSCC)是頭頸部腫瘤中相對預(yù)后最差的惡性腫瘤,嚴重威脅人類生命健康,總的5年生存率在25%-40%。盡管目前下咽癌的診療手段在不斷改進,包括手術(shù)切除腫瘤、放療、化療及靶向治療等,但下咽癌病人的病死率仍居高不下。侵襲轉(zhuǎn)移是造成下咽癌治療失敗和患者死亡的最主要原因。因此,充分了解下咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控機制對于下咽癌轉(zhuǎn)移的早期診斷、提高患者生存率等都具有重要意義。細胞間黏附狀態(tài)的改變是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。低水平的上皮型鈣粘素(CDH1/E-cadherin)與腫瘤的轉(zhuǎn)移以及病人的預(yù)后不良密切相關(guān)。另外,惡性腫瘤中存在某種因素可使MMP-9過度表達,導(dǎo)致基質(zhì)降解,有利于腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移。研究表明在頭頸部鱗癌及非小細胞肺癌中CDH1表達降低能夠轉(zhuǎn)錄激活表皮生長因子受體(EGFR),最終促進細胞增殖。EGFR是受體酪氨酸激酶(RTK)的一種,RTK可以使信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)磷酸化,一旦STAT3被活化,它將會調(diào)控一系列靶基因(如MMP-9)的轉(zhuǎn)錄,從而影響腫瘤細胞的增殖,遷移和侵襲。然而,在下咽癌中CDH1下調(diào)影響MMP-9表達的精確分子機制并不清楚。綜上所述,下咽癌轉(zhuǎn)移與預(yù)后的關(guān)系密切,一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移,5年生存率較低,預(yù)后較差。因此深入研究下咽癌的轉(zhuǎn)移調(diào)控機制具有重要的臨床意義。CDH1功能的喪失可以影響對細胞外基質(zhì)(ECM)的調(diào)節(jié),這一機制可能與STAT3的磷酸化相關(guān)。而作為調(diào)控ECM的一種酶,MMP-9在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成中起到關(guān)鍵的作用。目前,CDH1/STAT3/MMP-9信號通路在下咽癌中的機制尚不明確。因而,有必要對這一個分子機制問題進行深入研究。研究方法與分組1.本研究選取2010年06月至2014年12月期間在山東大學(xué)附屬山東省耳鼻喉醫(yī)院行根治性手術(shù),術(shù)前未進行輔助治療,病理及/或細胞學(xué)診斷為下咽鱗狀細胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HSCC)的患者共 109 例,其中下咽癌術(shù)后肺轉(zhuǎn)移患者31例,隨訪至少3年,獲得配對腫瘤及癌旁正常上皮組織樣本。研究內(nèi)容主要包括患者性別、年齡、病程時間、吸煙飲酒史、臨床表現(xiàn)、腫瘤部位、腫瘤分期、病理分級、術(shù)后是否存在遠處轉(zhuǎn)移,并且對術(shù)后生存時間、死亡原因等生存情況進行隨訪。2.免疫組化實驗:以兔CDH1和MMP-9單克隆抗體為主要抗體檢測CDH1和MMP-9的蛋白水平。3.細胞系為人類下咽癌FaDu細胞系。4.FaDu細胞的培養(yǎng)包括FaDu細胞復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)、接種以及凍存。5.蛋白印跡實驗包括細胞總蛋白的提取、考馬斯亮藍法測定蛋白濃度以及蛋白質(zhì)免疫印跡法。6.FaDu細胞siRNA轉(zhuǎn)染:待FaDu細胞覆蓋率達到60-80%時,進行siRNA轉(zhuǎn)染;siRNA 對照組靶向于 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'序列,STAT3的 siRNA 組靶向于 5'-GCAAGAUUCAGACCCUCAATT-3'序列,CDH1#1和#2的 siRNA 組 靶 向 于 5'-CAGACAAAGACCAGGACTA-3' 序列和5'-GCACGUACACAGCCCUAAU-3' 序列,MMP-9 的 siRNA 組靶向于5'-CAUCACCUAUUGGAUCCAA-3'序列。7.磺酰羅丹明 B(Sulforhodamine B,SRB)法:FaDu 細胞 siRNA 干預(yù) 24小時后重新接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)48小時。進行染色、漂洗和檢測吸光度值。8.細胞遷移實驗:FaDu細胞siRNA轉(zhuǎn)染處理48小時后,重新接種于Transwell小室中繼續(xù)培養(yǎng)24小時,固定、染色、清洗、計數(shù)。9.細胞侵襲實驗:FaDu細胞siRNA轉(zhuǎn)染處理48小時后,重新接種于鋪好Matrigel膠的Transwell小室中繼續(xù)培養(yǎng)36小時,固定、染色、清洗、計數(shù)。10.CCK-8實驗:使用siRNA干預(yù)FaDu細胞24小時后,制備細胞懸液并重新接種FaDu細胞到96孔細胞培養(yǎng)板,繼續(xù)培養(yǎng)48小時,向每孔加入10μl的CCK-8試劑液,在培養(yǎng)箱中孵育2小時后,檢測吸光度值。研究內(nèi)容及研究成果1.CDH1表達與下咽癌轉(zhuǎn)移及臨床預(yù)后的相關(guān)研究1.1 CDH1與下咽鱗狀細胞癌肺轉(zhuǎn)移相關(guān)為了探究CDH1在HSCC進展中的作用,我們通過免疫組化(IHC)染色研究了109例患者癌及癌旁正常上皮組織中CDH1的表達水平,其中31例存在下咽癌術(shù)后肺轉(zhuǎn)移。CDH1在癌組織中的陰性表達(16/109)高于癌旁正常上皮組織(5/109)(P=0.012,Mann-Whitney U 檢驗);與無肺轉(zhuǎn)移的 HSCC 組織(5/78)相比,CDH1在存在肺轉(zhuǎn)移的HSCC組織中陰性表達顯著增高(11/31)(P0.01,χ2檢驗);CDH1陰性表達和中等陽性或強陽性表達的差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01,χ2檢驗)。我們對CDH1表達與HSCC肺轉(zhuǎn)移的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)檢驗,發(fā)現(xiàn)二者呈顯著負相關(guān)(r=-0.431,P0.01)。1.2 CDH1表達和HSCC臨床預(yù)后相關(guān)單因素和多因素分析顯示,CDH1的低表達與總生存時間和無病生存時間較短有關(guān)(P0.05,log-rank檢驗),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與總生存時間較短有關(guān)(P0.05,log-rank檢驗)。CDH1陰性與HSCC患者復(fù)發(fā)顯著相關(guān)(P=0.001,χ2檢驗)。CDH1的表達與腫瘤的病理分期之間的相關(guān)性具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.025,χ2檢驗)。1.3 CDH1、MMP-9 在 HSCC 中的表達我們用免疫組織化學(xué)染色法比較CDH1和MMP-9在癌旁正常上皮組織和HSCC組織中的表達情況。CDH1的表達除了明顯定位于腫瘤細胞膜外,還表現(xiàn)出約60%的表達位于胞漿。然而,CDH1在癌旁正常上皮組織中基本只在細胞膜上表達。癌旁正常上皮組織(104/109)與癌組織中(93/109)CDH1陽性表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.012,Mann-WhitneyU檢驗)。我們發(fā)現(xiàn)在相同的HSCC樣本中,CDH1表達的減少往往伴隨著MMP-9表達的增加。2.CDH1表達下調(diào)誘導(dǎo)MMP-9表達的分子機制及功能研究2.1 CDH1表達下調(diào)誘導(dǎo)FaDu細胞中MMP-9表達上調(diào)我們應(yīng)用siRNA處理抑制CDH1在FaDu細胞中的表達,并通過Western blot實驗檢測MMP-9的水平。結(jié)果表明,CDH1表達降低的FaDu細胞,MMP-9表達高于對照組。2.2 CDH1表達下調(diào)通過p-STAT3上調(diào)MMP-9我們的研究數(shù)據(jù)顯示,CDH1的缺失導(dǎo)致p-STAT3顯著增加。我們通過siRNA轉(zhuǎn)染抑制STAT3和CDH1的表達,發(fā)現(xiàn)抑制STAT3后可以削弱CDH1下調(diào)所引起的MMP-9的表達上調(diào)。我們應(yīng)用AG490處理CDH1-siRNA轉(zhuǎn)染的FaDu細胞以抑制STAT3活化,發(fā)現(xiàn)STAT3的藥理抑制作用也阻止了 CDH1缺失觸發(fā)的MMP-9上調(diào)。2.3 CDH1表達下調(diào)通過STAT3和MMP-9促進FaDu細胞的增殖CDH1 siRNA處理的FaDu細胞生長增殖增強,而轉(zhuǎn)染STAT3或MMP-9 siRNA的FaDu細胞生長增殖明顯下降。此外,同時抑制CDH1和STAT3或MMP-9后明顯減弱CDH1沉默誘導(dǎo)的細胞高增殖能力。2.4 CDH1表達下調(diào)通過STAT3和MMP-9提高FaDu細胞的遷移和侵襲能力與對照組相比,CDH1沉默的FaDu細胞的遷移和侵襲能力明顯增強。相反,STAT3或MMP-9 siRNA處理的FaDu細胞遷移和侵襲能力明顯下降。此外,沉默STAT3能夠降低CDH1缺失所引起的FaDu細胞的高遷移侵襲能力。研究結(jié)論CDH1是HSCC肺轉(zhuǎn)移和預(yù)后的有力預(yù)測指標,進一步的機制研究表明下咽癌細胞中CDH1表達下調(diào)通過磷酸化STAT3上調(diào)MMP-9表達進而促進下咽癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移,最終影響HSCC的惡性發(fā)展和肺轉(zhuǎn)移。我們的研究可能為HSCC肺轉(zhuǎn)移提供新的治療靶點,從而為進一步提升臨床預(yù)后和開辟潛在的治療途徑提供科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.63
【部分圖文】：

（５／１０９）（尸＝０．０１２，邋Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ邋Ｕ檢驗）。值得注意的是，與無肺轉(zhuǎn)移的ＨＳＣＣ逡逑組織（５／７８）相比，ＣＤＨ丨在存在肺轉(zhuǎn)移的ＨＳＣＣ組織中陰性表達（１１／３１）顯著逡逑增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＜邋0．0１，Ｘ２檢驗；見表１和圖１）。１６例ＣＤＨ１表逡逑達陰性的ＨＳＣＣ患者中有１１例發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，肺轉(zhuǎn)移率為６８．７５％。１２例ＣＤＨ１逡逑表達弱陽性（＋）的ＨＳＣＣ患者中有６例發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，肺轉(zhuǎn)移率為５０％。ＣＤＨ１逡逑表達中等陽性（＋＋）和強陽性（＋＋＋）的患者肺轉(zhuǎn)移率分別為２４．３２％邋（９／３７）和逡逑ＩＩ．

我們用免疫組織化學(xué)染色法比較ＣＤＨ１和ＭＭＰ－９在癌旁正常上皮組織和逡逑ＨＳＣＣ組織中的表達情況。ＣＤＨ１的表達除了明顯定位于腫瘤細胞膜外，還表現(xiàn)逡逑出約６０％的表達位于胞漿（見圖３邋Ａ－Ｃ）。然而，ＣＤＨ１在癌旁正常上皮組織中逡逑基本只在細胞膜上表達（見圖４Ａ和圖４Ｂ）ＸＤＨ１在癌旁正常上皮組織（１０４／１０９）逡逑與腫瘤組（９３／１０９）的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＝０．０１２，Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ檢驗；逡逑見圖４Ｂ和４Ｄ）。ＭＭＰ－９在癌旁正常上皮組織和腫瘤組織中均有表達，主要表現(xiàn)逡逑為胞漿彌漫性染色，偶爾表達于腫瘤細胞的細胞膜上（見圖３邋Ｄ－Ｆ）。ＭＭＰ－９在逡逑腫瘤組織中的表達（６１Ａ０９）明顯高于在癌旁正常上皮組織中的表達（１４／１０９）逡逑（Ｐ＜０．００１，Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ檢驗；圖４Ｆ和４Ｈ）。同時，我們發(fā)現(xiàn)在相同的ＨＳＣＣ逡逑樣本￥，ＣＤＨ１表達減少，而ＭＭＰ－９表達則相應(yīng)增加圖４Ｄ和４Ｈ），這表逡逑明ＣＤＨ１表達可能與ＨＳＣＣ中ＭＭＰ－９表達相關(guān)。逡逑ｂ逡逑１、怎邐Ｈ邐、邐ＭＭＰ－９逡逑圖３．邋ＣＤＨ１和ＭＭＰ－９在ＨＳＣＣ組織中的表達部位逡逑（Ａ）邋ＣＤＨ１的膜表達；（Ｂ）邋ＣＤＨ１的細胞質(zhì)表達；（Ｃ）邋ＣＤＨ１的膜和細胞逡逑質(zhì)表達；（Ｄ）ＭＭＰ－９的膜免疫染色；（Ｅ）ＭＭＰ－９的彌散細胞質(zhì)表達；（Ｆ）ＭＭＰ－９逡逑的膜和細胞質(zhì)染色。（放大倍數(shù)ｘ２０）。逡逑

ＨＳＣＣ組織中的表達情況。ＣＤＨ１的表達除了明顯定位于腫瘤細胞膜外，還表現(xiàn)逡逑出約６０％的表達位于胞漿（見圖３邋Ａ－Ｃ）。然而，ＣＤＨ１在癌旁正常上皮組織中逡逑基本只在細胞膜上表達（見圖４Ａ和圖４Ｂ）ＸＤＨ１在癌旁正常上皮組織（１０４／１０９）逡逑與腫瘤組（９３／１０９）的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＝０．０１２，Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ檢驗；逡逑見圖４Ｂ和４Ｄ）。ＭＭＰ－９在癌旁正常上皮組織和腫瘤組織中均有表達，主要表現(xiàn)逡逑為胞漿彌漫性染色，偶爾表達于腫瘤細胞的細胞膜上（見圖３邋Ｄ－Ｆ）。ＭＭＰ－９在逡逑腫瘤組織中的表達（６１Ａ０９）明顯高于在癌旁正常上皮組織中的表達（１４／１０９）逡逑（Ｐ＜０．００１，Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ檢驗；圖４Ｆ和４Ｈ）。同時，我們發(fā)現(xiàn)在相同的ＨＳＣＣ逡逑樣本￥，ＣＤＨ１表達減少，而ＭＭＰ－９表達則相應(yīng)增加圖４Ｄ和４Ｈ），這表逡逑明ＣＤＨ１表達可能與ＨＳＣＣ中ＭＭＰ－９表達相關(guān)。逡逑ｂ逡逑１、怎邐Ｈ邐、邐ＭＭＰ－９逡逑圖３．邋ＣＤＨ１和ＭＭＰ－９在ＨＳＣＣ組織中的表達部位逡逑（Ａ）邋ＣＤＨ１的膜表達；（Ｂ）邋ＣＤＨ１的細胞質(zhì)表達；（Ｃ）邋ＣＤＨ１的膜和細胞逡逑質(zhì)表達；（Ｄ）ＭＭＰ－９的膜免疫染色；（Ｅ）ＭＭＰ－９的彌散細胞質(zhì)表達；（Ｆ）ＭＭＰ－９逡逑的膜和細胞質(zhì)染色。（放大倍數(shù)ｘ２０）。逡逑＃邋？逡逑３４逡逑

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本文編號：2828402