研究背景和目的下咽鱗狀細(xì)胞癌(HSCC)是頭頸部腫瘤中相對(duì)預(yù)后最差的惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅人類生命健康,總的5年生存率在25%-40%。盡管目前下咽癌的診療手段在不斷改進(jìn),包括手術(shù)切除腫瘤、放療、化療及靶向治療等,但下咽癌病人的病死率仍居高不下。侵襲轉(zhuǎn)移是造成下咽癌治療失敗和患者死亡的最主要原因。因此,充分了解下咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控機(jī)制對(duì)于下咽癌轉(zhuǎn)移的早期診斷、提高患者生存率等都具有重要意義。細(xì)胞間黏附狀態(tài)的改變是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。低水平的上皮型鈣粘素(CDH1/E-cadherin)與腫瘤的轉(zhuǎn)移以及病人的預(yù)后不良密切相關(guān)。另外,惡性腫瘤中存在某種因素可使MMP-9過(guò)度表達(dá),導(dǎo)致基質(zhì)降解,有利于腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。研究表明在頭頸部鱗癌及非小細(xì)胞肺癌中CDH1表達(dá)降低能夠轉(zhuǎn)錄激活表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR),最終促進(jìn)細(xì)胞增殖。EGFR是受體酪氨酸激酶(RTK)的一種,RTK可以使信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)磷酸化,一旦STAT3被活化,它將會(huì)調(diào)控一系列靶基因(如MMP-9)的轉(zhuǎn)錄,從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲。然而,在下咽癌中CDH1下調(diào)影響MMP-9表達(dá)的精確分子機(jī)制并不清楚。綜上所述,下咽癌轉(zhuǎn)移與預(yù)后的關(guān)系密切,一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移,5年生存率較低,預(yù)后較差。因此深入研究下咽癌的轉(zhuǎn)移調(diào)控機(jī)制具有重要的臨床意義。CDH1功能的喪失可以影響對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的調(diào)節(jié),這一機(jī)制可能與STAT3的磷酸化相關(guān)。而作為調(diào)控ECM的一種酶,MMP-9在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成中起到關(guān)鍵的作用。目前,CDH1/STAT3/MMP-9信號(hào)通路在下咽癌中的機(jī)制尚不明確。因而,有必要對(duì)這一個(gè)分子機(jī)制問(wèn)題進(jìn)行深入研究。研究方法與分組1.本研究選取2010年06月至2014年12月期間在山東大學(xué)附屬山東省耳鼻喉醫(yī)院行根治性手術(shù),術(shù)前未進(jìn)行輔助治療,病理及/或細(xì)胞學(xué)診斷為下咽鱗狀細(xì)胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HSCC)的患者共 109 例,其中下咽癌術(shù)后肺轉(zhuǎn)移患者31例,隨訪至少3年,獲得配對(duì)腫瘤及癌旁正常上皮組織樣本。研究?jī)?nèi)容主要包括患者性別、年齡、病程時(shí)間、吸煙飲酒史、臨床表現(xiàn)、腫瘤部位、腫瘤分期、病理分級(jí)、術(shù)后是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,并且對(duì)術(shù)后生存時(shí)間、死亡原因等生存情況進(jìn)行隨訪。2.免疫組化實(shí)驗(yàn):以兔CDH1和MMP-9單克隆抗體為主要抗體檢測(cè)CDH1和MMP-9的蛋白水平。3.細(xì)胞系為人類下咽癌FaDu細(xì)胞系。4.FaDu細(xì)胞的培養(yǎng)包括FaDu細(xì)胞復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)、接種以及凍存。5.蛋白印跡實(shí)驗(yàn)包括細(xì)胞總蛋白的提取、考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度以及蛋白質(zhì)免疫印跡法。6.FaDu細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染:待FaDu細(xì)胞覆蓋率達(dá)到60-80%時(shí),進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染;siRNA 對(duì)照組靶向于 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'序列,STAT3的 siRNA 組靶向于 5'-GCAAGAUUCAGACCCUCAATT-3'序列,CDH1#1和#2的 siRNA 組 靶 向 于 5'-CAGACAAAGACCAGGACTA-3' 序列和5'-GCACGUACACAGCCCUAAU-3' 序列,MMP-9 的 siRNA 組靶向于5'-CAUCACCUAUUGGAUCCAA-3'序列。7.磺酰羅丹明 B(Sulforhodamine B,SRB)法:FaDu 細(xì)胞 siRNA 干預(yù) 24小時(shí)后重新接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。進(jìn)行染色、漂洗和檢測(cè)吸光度值。8.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):FaDu細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染處理48小時(shí)后,重新接種于Transwell小室中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),固定、染色、清洗、計(jì)數(shù)。9.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):FaDu細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染處理48小時(shí)后,重新接種于鋪好Matrigel膠的Transwell小室中繼續(xù)培養(yǎng)36小時(shí),固定、染色、清洗、計(jì)數(shù)。10.CCK-8實(shí)驗(yàn):使用siRNA干預(yù)FaDu細(xì)胞24小時(shí)后,制備細(xì)胞懸液并重新接種FaDu細(xì)胞到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí),向每孔加入10μl的CCK-8試劑液,在培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)后,檢測(cè)吸光度值。研究?jī)?nèi)容及研究成果1.CDH1表達(dá)與下咽癌轉(zhuǎn)移及臨床預(yù)后的相關(guān)研究1.1 CDH1與下咽鱗狀細(xì)胞癌肺轉(zhuǎn)移相關(guān)為了探究CDH1在HSCC進(jìn)展中的作用,我們通過(guò)免疫組化(IHC)染色研究了109例患者癌及癌旁正常上皮組織中CDH1的表達(dá)水平,其中31例存在下咽癌術(shù)后肺轉(zhuǎn)移。CDH1在癌組織中的陰性表達(dá)(16/109)高于癌旁正常上皮組織(5/109)(P=0.012,Mann-Whitney U 檢驗(yàn));與無(wú)肺轉(zhuǎn)移的 HSCC 組織(5/78)相比,CDH1在存在肺轉(zhuǎn)移的HSCC組織中陰性表達(dá)顯著增高(11/31)(P0.01,χ2檢驗(yàn));CDH1陰性表達(dá)和中等陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)的差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01,χ2檢驗(yàn))。我們對(duì)CDH1表達(dá)與HSCC肺轉(zhuǎn)移的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)二者呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.431,P0.01)。1.2 CDH1表達(dá)和HSCC臨床預(yù)后相關(guān)單因素和多因素分析顯示,CDH1的低表達(dá)與總生存時(shí)間和無(wú)病生存時(shí)間較短有關(guān)(P0.05,log-rank檢驗(yàn)),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與總生存時(shí)間較短有關(guān)(P0.05,log-rank檢驗(yàn))。CDH1陰性與HSCC患者復(fù)發(fā)顯著相關(guān)(P=0.001,χ2檢驗(yàn))。CDH1的表達(dá)與腫瘤的病理分期之間的相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025,χ2檢驗(yàn))。1.3 CDH1、MMP-9 在 HSCC 中的表達(dá)我們用免疫組織化學(xué)染色法比較CDH1和MMP-9在癌旁正常上皮組織和HSCC組織中的表達(dá)情況。CDH1的表達(dá)除了明顯定位于腫瘤細(xì)胞膜外,還表現(xiàn)出約60%的表達(dá)位于胞漿。然而,CDH1在癌旁正常上皮組織中基本只在細(xì)胞膜上表達(dá)。癌旁正常上皮組織(104/109)與癌組織中(93/109)CDH1陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012,Mann-WhitneyU檢驗(yàn))。我們發(fā)現(xiàn)在相同的HSCC樣本中,CDH1表達(dá)的減少往往伴隨著MMP-9表達(dá)的增加。2.CDH1表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)的分子機(jī)制及功能研究2.1 CDH1表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞中MMP-9表達(dá)上調(diào)我們應(yīng)用siRNA處理抑制CDH1在FaDu細(xì)胞中的表達(dá),并通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MMP-9的水平。結(jié)果表明,CDH1表達(dá)降低的FaDu細(xì)胞,MMP-9表達(dá)高于對(duì)照組。2.2 CDH1表達(dá)下調(diào)通過(guò)p-STAT3上調(diào)MMP-9我們的研究數(shù)據(jù)顯示,CDH1的缺失導(dǎo)致p-STAT3顯著增加。我們通過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染抑制STAT3和CDH1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)抑制STAT3后可以削弱CDH1下調(diào)所引起的MMP-9的表達(dá)上調(diào)。我們應(yīng)用AG490處理CDH1-siRNA轉(zhuǎn)染的FaDu細(xì)胞以抑制STAT3活化,發(fā)現(xiàn)STAT3的藥理抑制作用也阻止了 CDH1缺失觸發(fā)的MMP-9上調(diào)。2.3 CDH1表達(dá)下調(diào)通過(guò)STAT3和MMP-9促進(jìn)FaDu細(xì)胞的增殖CDH1 siRNA處理的FaDu細(xì)胞生長(zhǎng)增殖增強(qiáng),而轉(zhuǎn)染STAT3或MMP-9 siRNA的FaDu細(xì)胞生長(zhǎng)增殖明顯下降。此外,同時(shí)抑制CDH1和STAT3或MMP-9后明顯減弱CDH1沉默誘導(dǎo)的細(xì)胞高增殖能力。2.4 CDH1表達(dá)下調(diào)通過(guò)STAT3和MMP-9提高FaDu細(xì)胞的遷移和侵襲能力與對(duì)照組相比,CDH1沉默的FaDu細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)。相反,STAT3或MMP-9 siRNA處理的FaDu細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯下降。此外,沉默STAT3能夠降低CDH1缺失所引起的FaDu細(xì)胞的高遷移侵襲能力。研究結(jié)論CDH1是HSCC肺轉(zhuǎn)移和預(yù)后的有力預(yù)測(cè)指標(biāo),進(jìn)一步的機(jī)制研究表明下咽癌細(xì)胞中CDH1表達(dá)下調(diào)通過(guò)磷酸化STAT3上調(diào)MMP-9表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)下咽癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,最終影響HSCC的惡性發(fā)展和肺轉(zhuǎn)移。我們的研究可能為HSCC肺轉(zhuǎn)移提供新的治療靶點(diǎn),從而為進(jìn)一步提升臨床預(yù)后和開(kāi)辟潛在的治療途徑提供科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.63
【部分圖文】：

（５／１０９）（尸＝０．０１２，邋Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ邋Ｕ檢驗(yàn)）。值得注意的是，與無(wú)肺轉(zhuǎn)移的ＨＳＣＣ逡逑組織（５／７８）相比，ＣＤＨ丨在存在肺轉(zhuǎn)移的ＨＳＣＣ組織中陰性表達(dá)（１１／３１）顯著逡逑增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜邋0．0１，Ｘ２檢驗(yàn)；見(jiàn)表１和圖１）。１６例ＣＤＨ１表逡逑達(dá)陰性的ＨＳＣＣ患者中有１１例發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，肺轉(zhuǎn)移率為６８．７５％。１２例ＣＤＨ１逡逑表達(dá)弱陽(yáng)性（＋）的ＨＳＣＣ患者中有６例發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，肺轉(zhuǎn)移率為５０％。ＣＤＨ１逡逑表達(dá)中等陽(yáng)性（＋＋）和強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋）的患者肺轉(zhuǎn)移率分別為２４．３２％邋（９／３７）和逡逑ＩＩ．

我們用免疫組織化學(xué)染色法比較ＣＤＨ１和ＭＭＰ－９在癌旁正常上皮組織和逡逑ＨＳＣＣ組織中的表達(dá)情況。ＣＤＨ１的表達(dá)除了明顯定位于腫瘤細(xì)胞膜外，還表現(xiàn)逡逑出約６０％的表達(dá)位于胞漿（見(jiàn)圖３邋Ａ－Ｃ）。然而，ＣＤＨ１在癌旁正常上皮組織中逡逑基本只在細(xì)胞膜上表達(dá)（見(jiàn)圖４Ａ和圖４Ｂ）ＸＤＨ１在癌旁正常上皮組織（１０４／１０９）逡逑與腫瘤組（９３／１０９）的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＝０．０１２，Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ檢驗(yàn)；逡逑見(jiàn)圖４Ｂ和４Ｄ）。ＭＭＰ－９在癌旁正常上皮組織和腫瘤組織中均有表達(dá)，主要表現(xiàn)逡逑為胞漿彌漫性染色，偶爾表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜上（見(jiàn)圖３邋Ｄ－Ｆ）。ＭＭＰ－９在逡逑腫瘤組織中的表達(dá)（６１Ａ０９）明顯高于在癌旁正常上皮組織中的表達(dá)（１４／１０９）逡逑（Ｐ＜０．００１，Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ檢驗(yàn)；圖４Ｆ和４Ｈ）。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在相同的ＨＳＣＣ逡逑樣本￥，ＣＤＨ１表達(dá)減少，而ＭＭＰ－９表達(dá)則相應(yīng)增加圖４Ｄ和４Ｈ），這表逡逑明ＣＤＨ１表達(dá)可能與ＨＳＣＣ中ＭＭＰ－９表達(dá)相關(guān)。逡逑ｂ逡逑１、怎邐Ｈ邐、邐ＭＭＰ－９逡逑圖３．邋ＣＤＨ１和ＭＭＰ－９在ＨＳＣＣ組織中的表達(dá)部位逡逑（Ａ）邋ＣＤＨ１的膜表達(dá)；（Ｂ）邋ＣＤＨ１的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)；（Ｃ）邋ＣＤＨ１的膜和細(xì)胞逡逑質(zhì)表達(dá)；（Ｄ）ＭＭＰ－９的膜免疫染色；（Ｅ）ＭＭＰ－９的彌散細(xì)胞質(zhì)表達(dá)；（Ｆ）ＭＭＰ－９逡逑的膜和細(xì)胞質(zhì)染色。（放大倍數(shù)ｘ２０）。逡逑

ＨＳＣＣ組織中的表達(dá)情況。ＣＤＨ１的表達(dá)除了明顯定位于腫瘤細(xì)胞膜外，還表現(xiàn)逡逑出約６０％的表達(dá)位于胞漿（見(jiàn)圖３邋Ａ－Ｃ）。然而，ＣＤＨ１在癌旁正常上皮組織中逡逑基本只在細(xì)胞膜上表達(dá)（見(jiàn)圖４Ａ和圖４Ｂ）ＸＤＨ１在癌旁正常上皮組織（１０４／１０９）逡逑與腫瘤組（９３／１０９）的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＝０．０１２，Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ檢驗(yàn)；逡逑見(jiàn)圖４Ｂ和４Ｄ）。ＭＭＰ－９在癌旁正常上皮組織和腫瘤組織中均有表達(dá)，主要表現(xiàn)逡逑為胞漿彌漫性染色，偶爾表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜上（見(jiàn)圖３邋Ｄ－Ｆ）。ＭＭＰ－９在逡逑腫瘤組織中的表達(dá)（６１Ａ０９）明顯高于在癌旁正常上皮組織中的表達(dá)（１４／１０９）逡逑（Ｐ＜０．００１，Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ檢驗(yàn)；圖４Ｆ和４Ｈ）。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在相同的ＨＳＣＣ逡逑樣本￥，ＣＤＨ１表達(dá)減少，而ＭＭＰ－９表達(dá)則相應(yīng)增加圖４Ｄ和４Ｈ），這表逡逑明ＣＤＨ１表達(dá)可能與ＨＳＣＣ中ＭＭＰ－９表達(dá)相關(guān)。逡逑ｂ逡逑１、怎邐Ｈ邐、邐ＭＭＰ－９逡逑圖３．邋ＣＤＨ１和ＭＭＰ－９在ＨＳＣＣ組織中的表達(dá)部位逡逑（Ａ）邋ＣＤＨ１的膜表達(dá)；（Ｂ）邋ＣＤＨ１的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)；（Ｃ）邋ＣＤＨ１的膜和細(xì)胞逡逑質(zhì)表達(dá)；（Ｄ）ＭＭＰ－９的膜免疫染色；（Ｅ）ＭＭＰ－９的彌散細(xì)胞質(zhì)表達(dá)；（Ｆ）ＭＭＰ－９逡逑的膜和細(xì)胞質(zhì)染色。（放大倍數(shù)ｘ２０）。逡逑＃邋？逡逑３４逡逑

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 秦蕾;張軍峰;楊亞平;李謹(jǐn);佟書(shū)娟;張春兵;趙旺勝;楊學(xué)文;邱紅;董偉;詹tg;;CDH1基因多態(tài)性與胃腺癌患者舌苔辨證的相關(guān)性[J];世界華人消化雜志;2012年14期

2 鄒小量;朱勝華;楊枝芳;莫僑;;CDH1基因-160C/A基因多態(tài)性與鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的研究[J];中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志;2013年06期

3 于月成;辛?xí)匝?李紅梅;李奇靈;袁鵬;滑偉;張明;;CDH1基因啟動(dòng)子甲基化在上皮性卵巢癌轉(zhuǎn)移方面的研究[J];免疫學(xué)雜志;2006年02期

4 宋傳貴,黃昌明,劉星,盧輝山,張祥福,黃薇;CDH1基因-160(C→A)多態(tài)與福建地區(qū)中國(guó)人群胃癌遺傳易感性的關(guān)聯(lián)研究[J];中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志;2005年05期

5 邱瑾;姚文龍;張s

本文編號(hào)：2828402