本文關鍵詞：關于RAGE-配體系統(tǒng)在慢性間歇性低氧致動脈粥樣硬化機制中的作用的初期體外研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)是導致動脈粥樣硬化(AS)的重要原因之一,但關于其具體作用機制目前尚未闡明。而OSAHS的典型病理特征表現為慢性間歇性低氧(IH),其可能是OSAHS導致AS的關鍵因素。多項研究指出,RAGE-配體系統(tǒng)在動脈粥樣硬化的發(fā)病機制中起著非常重要的作用,而IH能夠激活AGEs/RAGE系統(tǒng)。因此,本研究擬基于RAGE-配體系統(tǒng),探討慢性IH導致AS的相關機制。首先,在體外實驗中,使用RNAi沉默目的基因RAGE,檢測IH對THP-1源性巨噬細胞的轉化、泡沫細胞的形成及膽固醇運輸蛋白的調節(jié)等方面的影響。實驗初期主要完成如下兩項:一是通過優(yōu)化PMA誘導分化THP-1細胞的條件,成功誘導出THP-1源性巨噬細胞,建立巨噬細胞實驗模型,用于后續(xù)AS致病機制的觀察。二是構建并篩選出最佳sh RNA/RAGE慢病毒載體并感染THP-1細胞,以期到達沉默THP-1細胞RAGE基因效果,便于用于后續(xù)實驗分組。方法:體外培養(yǎng)THP-1細胞;PMA誘導THP-1細胞分化為THP-1源性巨噬細胞,通過形態(tài)學觀察和流式細胞術檢測CD14、CD68陽性率,鑒定其誘導分化程度;構建sh RNA/RAGE慢病毒載體;sh RNA/RAGE慢病毒載體感染THP-1細胞,RTQ-PCR及Western-blot鑒定RAGE在THP-1細胞中的沉默情況;結果:1、流式細胞術測定誘導分化前后細胞表面標記物CD14、CD68的百分率,誘導前分別為3.5%、1.3%,誘導后表面標志物明顯升高,分別為37.7%、46.8%,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),實驗結果提示成功誘導出THP-1源性巨噬細胞。2、成功構建sh RNA/RAGE慢病毒載體,RT-PCR結果顯示,KD1、KD2、KD3組sh RNA/RAGE慢病毒載體對RAGE基因的抑制效果均不明顯,抑制率分別為47.8%、30.2%與29.4%;Western-blot結果顯示,KD1、KD2、KD3組慢病毒載體對RAGE蛋白表達抑制效果不佳,抑制率分別為41.2%、14.9%與11。3%,提示KD1、KD2、KD3組sh RNA/RAGE慢病毒載體均未能成功產生基因沉默效果,不可用于后續(xù)實驗,需重新設計sh RNA/RAGE慢病毒載體或者使用其他方法阻斷RAGE—配體信號通路。結論:1、PMA成功誘導出THP-1源性巨噬細胞,成功建立巨噬細胞實驗模型。2、成功構建了sh RNA/RAGE慢病毒載體,KD1、KD2、KD3組sh RNA/RAGE慢病毒載體均可成功感染THP-1細胞但均未能產生有效的基因沉默效果,需要進一步摸索沉默RAGE基因的相關實驗方法。
【關鍵詞】：晚期糖基化終末產物受體 RNA干擾 人單核細胞白血病細胞 佛波酯
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R766;R543.5
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文略縮詞表9-11
• 第1章 前言11-13
• 第2章 材料與方法13-28
• 2.1 實驗對象13
• 2.2 主要實驗設備、試劑及其配置13-18
• 2.2.1 主要實驗設備13-14
• 2.2.2 主要試劑及配置14-18
• 2.3 主要方法與步驟18-27
• 2.3.1 THP-1 細胞培養(yǎng)19-20
• 2.3.2 THP-1 細胞誘導分化20
• 2.3.3 流式細胞術對PMA誘導分化后的THP-1 源性巨噬細胞的鑒定20-21
• 2.3.4 sh RNA/RAGE 慢病毒載體構建及細胞感染21-24
• 2.3.5 RTQ-PCR檢測RAGE基因沉默效果24-26
• 2.3.6 Western blot檢測RAGE蛋白表達率26-27
• 2.4 統(tǒng)計學處理27-28
• 第3章 結果28-36
• 3.1 PMA對THP-1 細胞誘導分化形態(tài)學觀察28-29
• 3.1.1 正常THP-1 細胞及THP-1 源性巨噬細胞28
• 3.1.2 PMA不同誘導時間及濃度下THP-1 形態(tài)變化28-29
• 3.2 THP-1 源性巨噬細胞流式鑒定29-30
• 3.3 shRNA/RAGE慢病毒載體的構建結果30-32
• 3.4 shRNA/RAGE慢病毒載體細胞感染THP-132-33
• 3.5 shRNA/RAGE慢病毒載體感染THP-1 后對RAGE沉默情況33-36
• 3.5.1 RTQ-PCR結果33-34
• 3.5.2 Western-blot結果34-36
• 第4章 討論36-42
• 4.1 關于THP-1 誘導的分化36-38
• 4.2 RNA干擾方法選擇與應用38-40
• 4.3 RAGE、OSAHS與AS相互關系40-42
• 第5章 結論與展望42-43
• 5.1 結論42
• 5.2 展望42-43
• 致謝43-44
• 參考文獻44-47
• 綜述47-55
• 參考文獻52-55

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前1條

1 吳海霞;張維銘;李曉眠;;基因轉染技術的發(fā)展與現狀[J];國際生物醫(yī)學工程雜志;2007年06期

  本文關鍵詞：關于RAGE-配體系統(tǒng)在慢性間歇性低氧致動脈粥樣硬化機制中的作用的初期體外研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：280979