發(fā)布時(shí)間：2020-08-19 12:35

【摘要】：背景:視網(wǎng)膜是一個(gè)極易受到年齡因素影響的器官組織,往往會(huì)隨著年齡增高出現(xiàn)結(jié)構(gòu)改變和功能退化。而且,視網(wǎng)膜的老化與許多年齡相關(guān)性視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生密切相關(guān),例如AMD、glaucoma、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞、高血壓動(dòng)脈硬化眼底病等。這些疾病嚴(yán)重影響了人們的視覺質(zhì)量,甚至導(dǎo)致失明。因此,為了延緩視網(wǎng)膜的衰老,改善視網(wǎng)膜功能,減少視網(wǎng)膜年齡相關(guān)疾病的發(fā)生,近年來,人們努力探索影響視網(wǎng)膜衰老的各種因素。但視網(wǎng)膜老化的機(jī)制仍然不清楚,而且視網(wǎng)膜年齡相關(guān)疾病的發(fā)生率也在不斷增高。干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferon Regulatory Factor 3,IRF3)是參與抗病毒反應(yīng)的核心轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)病毒感染宿主時(shí),IRF3會(huì)活化并進(jìn)入細(xì)胞核誘導(dǎo)大量Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生,從而抵抗病毒感染。近幾年來,隨著研究的不斷深入,IRF3相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控機(jī)制等方面取得重大進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn),除抗病毒作用之外,IRF3還可以在多種刺激條件下激活,例如DNA損傷,應(yīng)激誘導(dǎo)因素、生長因子、細(xì)胞因子刺激等,從而發(fā)揮響應(yīng)DNA損傷,調(diào)控細(xì)胞生長,抗腫瘤等重要作用。有研究證實(shí),在病理因素干預(yù)條件下,IRF3還可以參與某些視網(wǎng)膜老化相關(guān)疾病的病理變化過程。以上研究提示,IRF3可能在視網(wǎng)膜老化的過程中扮演了非常重要的角色,但其具體的作用仍然缺乏相關(guān)證據(jù)。目的:通過對(duì)正常WT和Irf3~(-/-)鼠的對(duì)比研究,觀察在IRF3缺失條件下,視網(wǎng)膜老化相關(guān)的結(jié)構(gòu)和功能改變,并通過G10(IRF3激動(dòng)劑)進(jìn)行干預(yù),從而探索IRF3對(duì)視網(wǎng)膜老化的作用和機(jī)制,為延緩視網(wǎng)膜衰老,減少視網(wǎng)膜老化相關(guān)疾病的發(fā)生提供新的思路和研究方向。方法:在體條件下,將以C57/BL6為背景的WT和Irf3~(-/-)鼠按照YA(Young adult)和Old兩個(gè)年齡段分為YA WT、YA Irf3~(-/-)、Old WT、Old Irf3~(-/-)共4個(gè)組,YA年齡為2~4個(gè)月,Old年齡為22~24個(gè)月。分別用S-OCT、HE染色、免疫熒光染色、電鏡技術(shù)、ERG對(duì)IRF3缺失后的小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能改變進(jìn)行評(píng)價(jià)。再結(jié)合Western blot、SA-β-gal染色對(duì)視網(wǎng)膜在IRF3缺失后的衰老狀態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)。利用Western blotting對(duì)引起視網(wǎng)膜變化的分子機(jī)制進(jìn)行研究。體外條件下,分別建立WT和Irf3~(-/-)鼠的原代RGC細(xì)胞缺氧衰退模型,并利用G10(IRF3激動(dòng)劑)進(jìn)行干預(yù)觀察。將WT和Irf3~(-/-)鼠的新生鼠RGC細(xì)胞分為WT+vehicle、Irf3~(-/-)+vehicle、WT+H_2O_2、Irf3~(-/-)+H_2O_2、WT+H_2O_2+G10、Irf3~(-/-)+H_2O_2+G10共6個(gè)組。分別用Western bloting、SA-β-gal染色對(duì)比分析IRF3的表達(dá)、老化相關(guān)標(biāo)記蛋白和SA-β-gal染色的表達(dá),并對(duì)相關(guān)作用的分子機(jī)制進(jìn)行研究。由于Irf3~(-/-)鼠在自然環(huán)境中易受病毒感染影響,為排除IRF3介導(dǎo)的炎性反應(yīng)作用,將HSV-1病毒直接感染W(wǎng)T和Irf3~(-/-)鼠角膜(模擬自然環(huán)境),再用流式細(xì)胞分選、免疫熒光染色、WB等技術(shù)分析視網(wǎng)膜和角膜改變,以及全身炎癥反應(yīng)。結(jié)果:1.由Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Old(老年)WT組的正常IRF3蛋白表達(dá)量比YA(年輕)WT組顯著降低(P0.05)。通過ERG檢查發(fā)現(xiàn),Irf3~(-/-)鼠的電生理功能比相同年齡段WT鼠明顯下降(P0.05)。進(jìn)一步用S-OCT、HE染色檢測(cè)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)顯示,Irf3~(-/-)鼠的視網(wǎng)膜厚度比相同年齡段WT鼠顯著減少(P0.05),并且以O(shè)PL層變化最為明顯。利用免疫熒光染色法對(duì)視網(wǎng)膜OPL層的突觸相關(guān)蛋白(Bassoon、PSD-95、Pkcα、Calbindin)進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn),Irf3~(-/-)鼠的視網(wǎng)膜OPL層突觸密度比相同年齡段WT鼠有明顯異位表現(xiàn)(P0.05)。同時(shí),OPL層的電鏡結(jié)果提示Irf3~(-/-)鼠的視網(wǎng)膜OPL層突觸密度比相同年齡段WT鼠顯著降低(P0.05)。2.通過對(duì)視網(wǎng)膜的Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Irf3~(-/-)鼠的衰老相關(guān)蛋白(P53、P16~(INK4a)、PML、P-H2A.X、IREα)表達(dá)量比相同年齡段WT鼠顯著增高(P0.05)。并且,SA-β-gal染色也提示,Irf3~(-/-)鼠的視網(wǎng)膜比相同年齡段WT鼠有更明顯的陽性染色變化(P0.05)。對(duì)大量相關(guān)分子進(jìn)行WB檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),Erk通路蛋白在Irf3~(-/-)組小鼠中的表達(dá)量異常增高(P0.05)。3.通過SA-β-gal染色檢測(cè)衰老細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn)Irf3~(-/-)+vehicle組比WT+vehicle組陽性染色細(xì)胞數(shù)增多(P0.05)。經(jīng)過H_2O_2處理后,WT和Irf3~(-/-)原代RGC細(xì)胞均比未處理組明顯增多,且Irf3~(-/-)組增多更為顯著(P0.05)。繼續(xù)使用G10分別處理WT+H_2O_2、Irf3~(-/-)+H_2O_2后,我們發(fā)現(xiàn)G10可以明顯減少H_2O_2對(duì)WT RGC細(xì)胞的衰退效應(yīng),但對(duì)Irf3~(-/-)RGC細(xì)胞的衰退效應(yīng)沒有明顯影響。Western blotting檢測(cè)RGC細(xì)胞IRF3蛋白、衰老相關(guān)蛋白、Erk蛋白提示,Irf3~(-/-)組比WT組有明顯神經(jīng)衰退表現(xiàn),G10不能明顯緩解,與SA-β-gal染色結(jié)果一致。4.細(xì)胞流式、免疫熒光染色、WB結(jié)果提示,受病毒角膜感染后,Irf3~(-/-)鼠與WT鼠相比更易引發(fā)全身感染,角膜也易出現(xiàn)明顯病變,但在正常SPF飼養(yǎng)條件下,兩組均未見明顯全身炎癥反應(yīng)差異(P0.05)。同時(shí),Irf3~(-/-)+HSV-1組與Irf3~(-/-)組視網(wǎng)膜突觸形態(tài)、衰老相關(guān)蛋白未見明顯差異(P0.05)。結(jié)論:本研究表明IRF3的缺失可以促進(jìn)小鼠視網(wǎng)膜老化相關(guān)改變,引起視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的相關(guān)變化。同時(shí),IRF3激動(dòng)劑G10的使用能夠一定程度上延緩視網(wǎng)膜衰老進(jìn)程。另外,IRF3缺失導(dǎo)致的Erk通路激活可能是影響視網(wǎng)膜老化相關(guān)改變的潛在機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R774.1
【圖文】：

21A、B: Western blot 檢測(cè)不同年齡 WT 鼠中的 IRF3 相對(duì)表達(dá)量，GAPDH 為內(nèi)參C: IRF3 在年輕和老年 WT 鼠視網(wǎng)膜中的熒光表達(dá)比較；D: IRF3(紅色)、PKCα(綠色色)在視網(wǎng)膜中表達(dá)的位置關(guān)系（n=3）；圖 1-1 IRF3 在視網(wǎng)膜的表達(dá)位置和不同年齡的表達(dá)量變化2.3.2 IRF3 缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜 ERG 功能的下降。ERG 是目前檢查視網(wǎng)膜電生理功能的有效手段。由于上述實(shí)驗(yàn)提示隨著年齡改變對(duì)視網(wǎng)膜有影響，我們進(jìn)一步應(yīng)用 ERG 對(duì) IRF3 缺失小鼠和鼠的視網(wǎng)膜生理功能進(jìn)行檢查比較。通過對(duì)同年齡段比較發(fā)現(xiàn)，Irf3-/-鼠的波幅明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(**P < 0.01, n=6)（圖 1-2 A，B）。同時(shí)，O波和 b 波波幅也明顯低于 YAWT 組(**P < 0.01, n=6)（圖 1-2 A，B）。提可能引起小鼠 ERG 生理功能明顯下降。

23A、B: OCT 測(cè)量小鼠視網(wǎng)膜厚度。A 圖中綠色方框?yàn)橐暰W(wǎng)膜測(cè)量區(qū)域，紅線為視網(wǎng)膜厚度 IML與 BM 膜；B: A 圖中各組視網(wǎng)膜測(cè)量的局部放大圖進(jìn)行對(duì)比；C: OCT 測(cè)量數(shù)據(jù)量化統(tǒng)計(jì)（***P <0.001, n=6）； D: HE 染色測(cè)量各組視網(wǎng)膜厚度，每組放大圖為對(duì)應(yīng)組黃色方框內(nèi)區(qū)域。E:視網(wǎng)膜總厚度以及各層厚度量化分析（* P > 0.01，** P > 0.01, ***P < 0.001, n=6）。圖 1-3 OCT 和 HE 染色對(duì)視網(wǎng)膜厚度測(cè)量2.3.4 IRF3 缺失導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜 OPL 層突觸異位以及 OPL 層突觸密度減少。研究表明，視網(wǎng)膜 OPL 層是光感受器細(xì)胞和中間神經(jīng)元形成突觸的特定視網(wǎng)膜層。通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Irf3-/-組小鼠視網(wǎng)膜厚度的改變以 OPL 層最為明顯，并且 IRF3

3.3 結(jié) 果3.3.1 IRF3 缺失引起 Erk 通路激活。近年來，IRF3 對(duì)衰老的調(diào)節(jié)作用得到了關(guān)注，但在視網(wǎng)膜的相關(guān)作用和機(jī)制仍然不明確。有研究表明，Erk 通路可以受 IRF3 下游 IFN-β調(diào)節(jié)發(fā)揮作用[55]，同時(shí)，Erk通路可以參與機(jī)體衰老的相關(guān)機(jī)制。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，與同年齡 WT 鼠相比，IRF3的缺失可以導(dǎo)致 Erk 信號(hào)通路蛋白顯著激活。包括 p-MEK1/2、P-44/42、p-P44/42、p-P90RSK 蛋白分子。而且，正常生理狀態(tài)下，Old WT 鼠與 YAWT 鼠相比，Erk 信號(hào)通路蛋白表達(dá)也明顯增高(*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，n=6)（圖 2-1 A，B）。通過對(duì) p-MEK1/2 的熒光染色，我們可以進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，不僅 p-MEK1/2 的表達(dá)趨勢(shì)與WB 結(jié)果相一致，而且其表達(dá)位置也與 IRF3 位置相近，同樣位于 OPL 層，(**P < 0.01，***P < 0.001，n=5)（圖 2-1 C，D）。

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本文編號(hào)：2797100