【摘要】：目的光感受器細(xì)胞的變性和壞死是各種視網(wǎng)膜疾病視力下降的最終環(huán)節(jié),包括視網(wǎng)膜脫離(retinal detachment,RD)。視網(wǎng)膜脫離后可發(fā)生一系列的病理變化,包括膠質(zhì)細(xì)胞增生、炎癥反應(yīng)和色素上皮細(xì)胞的增殖等。光感受器細(xì)胞的死亡機(jī)制復(fù)雜,包括自噬、凋亡、壞死和炎癥反應(yīng)等各種病理機(jī)制,并交錯影響。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥和促進(jìn)組織修復(fù)等功能。已有研究表明MSCs不是通過直接誘導(dǎo)分化而是以旁分泌的方式發(fā)揮治療作用。間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(exosomes derived from mesenchymal stem cells,MSC-exos)通過傳遞蛋白質(zhì)和RNA完成細(xì)胞間的通訊,可介導(dǎo)MSCs的多項(xiàng)生物學(xué)功能,已在多種動物模型中得到驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠視網(wǎng)膜脫離模型,觀察間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體對視網(wǎng)膜脫離是否具有治療效果,并初步探討MSC-exos發(fā)揮治療作用的機(jī)制,為MSC-exos在變性類眼部疾病中的臨床應(yīng)用奠定一定的基礎(chǔ)。方法1.培養(yǎng)原代間充質(zhì)干細(xì)胞:體外培養(yǎng)Sprague—Dawley(SD)大鼠骨髓干細(xì)胞來源的MSCs,傳代擴(kuò)增。2.收集并鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體:收集第3代至第5代培養(yǎng)MSCs的細(xì)胞上清液,超速離心后用大約200ul容積的磷酸鹽緩沖液重懸沉淀,分別用電鏡觀察法和免疫印跡分析法鑒定MSC-exos,最后用BCA蛋白定量試劑盒測量濃度后分裝儲存于-80oC冰箱中待用。3.大鼠視網(wǎng)膜脫離模型的建立:隨機(jī)將SD雄性大鼠分為正常組、對照組、PBS治療組和MSC-exos治療組,每組≥3只。視網(wǎng)膜下注射透明質(zhì)酸鈉建立視網(wǎng)膜脫離模型,并原位注射不同濃度的5ul MSC-exos或者5ul PBS。4.測定腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素1(Interleukin 1 beta,1L-1β)、單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)和白細(xì)胞介素6(Interleukin 6,IL-6)的m RNA表達(dá)水平,并確定MSC-exos最合適的治療濃度。5.免疫蛋白印跡法測定炎癥因子TNF-α和1L-1β,自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta,LC3)和自噬基因Atg5的蛋白表達(dá)水平。6.蘇木素-伊紅(HE)染色觀察視網(wǎng)膜組織病理變化:于造模后第7天處死各組大鼠并摘除眼球,Image J軟件測量外核層的厚度。7.原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)法檢測光感受器細(xì)胞凋亡:造模后第3天處死各組大鼠并摘除眼球,連續(xù)冰凍切片,TUNEL試劑盒檢測細(xì)胞凋亡,Image J軟件進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)。8.蛋白質(zhì)譜分析來源于大鼠的MSC-exos,檢測外泌體中蛋白質(zhì)的種類和功能。結(jié)果1.用不含外泌體的血清成功培養(yǎng)原代大鼠骨髓干細(xì)胞來源的MSCs,收集3至5代的上清液,經(jīng)典的超速離心法從上清液中提取外泌體,免疫蛋白印跡法證明有CD9和CD81的表達(dá),電鏡觀察到盤狀納米級囊泡。2.成功建立大鼠視網(wǎng)膜脫離模型。3.QRT-PCR顯示造模后第3天MCP-1、TNF-α、1L-1β和IL-6的m RNA表達(dá)水平均有增高,相比較于PBS治療組,MSC-exos治療組的TNF-α和1L-1β表達(dá)水平均有明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),并選定MSC-exos的最佳治療濃度為0.1mg/ml。4.免疫蛋白印跡法結(jié)果與QRT-PCR結(jié)果一致,相比較PBS治療組,MSC-exos治療顯著減少炎癥因子TNF-α和1L-1β的表達(dá),并且增加了自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-II/LC3-I和Atg5的表達(dá)水平。5.TUNEL法顯示造模后第3天,網(wǎng)脫部位出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞,相比較于PBS治療組,MSC-exos治療組的細(xì)胞陽性凋亡數(shù)明顯減少,組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。6.HE染色顯示造模后第7天,各組視網(wǎng)膜的組織結(jié)構(gòu)均紊亂且厚度變薄。MSC-exos能維持視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,減少外核層的丟失。7.蛋白質(zhì)譜分析顯示MSC-Exos內(nèi)含有具有抗炎、抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)作用的蛋白質(zhì)。結(jié)論MSC-exos能減輕大鼠視網(wǎng)膜脫離后的炎癥反應(yīng),增強(qiáng)自噬,減少光感受器細(xì)胞的凋亡,保護(hù)視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R774.12
【圖文】：

掃描電鏡顯示有很多直徑40 100nm之間雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的類圓形小囊泡，即外泌體。Western blot也證實(shí)MSC-exos具有外泌體的標(biāo)志，CD81和CD9。圖1 圖中可見很多類圓形小囊泡，直徑位于40-100nm之間，表面標(biāo)志蛋白CD81和CD9均有表達(dá)。2.2 MSC-Exos減輕網(wǎng)脫后的炎癥反應(yīng)研究顯示在網(wǎng)脫后第三天光感受器細(xì)胞死亡到達(dá)高峰期，炎癥因子水平顯著增高。MCP-1、TNF-α、1L-1β和IL-6在光感受器變性過程中起到重要作用。我們首先用PCR檢測不同濃度的MSC-Exo治療網(wǎng)脫的結(jié)果。PCR結(jié)果顯示在網(wǎng)脫后第3天，4種炎癥因子水平均有顯著增高，相對于PBS治療組而言，MSC-Exo明顯減少了TNF-α和1L-1β的表達(dá)，分別減少了63%和75%

10 xos對炎癥因子表達(dá)水平的影響。（A）PCR結(jié)果顯示網(wǎng)脫后F-α 和1L-1β均升高，MSC-Exos減少了TNF-α 和1L-1β的t 顯示網(wǎng)脫后第 3 天 TNF-α 和 1L-1β 水平升高，MSC-Exo表達(dá)。（N 組為正常組，C 組為視網(wǎng)膜脫離對照組，P 組 MSC-Exos 治療組，N≥3 只 P<0.05）os能維持視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和減少光感受器細(xì)胞器細(xì)胞的丟失是造成網(wǎng)脫患者視力喪失最主要的原因。有器死亡的主要形式，網(wǎng)脫后12小時就可以發(fā)現(xiàn)光感受器高峰。我們利用HE組織染色和TUNEL凋亡染色觀察MS微鏡下顯示正常組大鼠視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排脫后第7天，視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)紊亂，外核層變薄。HE病理和內(nèi)核層的厚度。相比較PBS治療組，MSC-Exo治療組

SC-Exos治療后視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)及細(xì)胞凋亡的變化。(A)網(wǎng)脫后脫離組、PBS治療組和MSC-Exos治療組的視網(wǎng)膜HE染色組，MSC-Exo治療組的ONL/INL比值水平明顯提高。(B)量增多，相比較PBS治療組而言，MSC-Exos治療組TUNE*P<0.05，n=3組)。xos增加了光感受器細(xì)胞的自噬受器細(xì)胞面對外界各種壓力時可激活自噬反應(yīng)。雖然自噬介導(dǎo)細(xì)胞的死亡，但是研究表明在大多數(shù)情況下自噬能保用免疫蛋白印跡法檢測了自噬標(biāo)志性因子 LC3 和 Atg5。rn Blot 結(jié)果顯示相比較 PBS 治療組，MSC-Exo 治療組 LC39%的提升，并且明顯減少了 Atg5 的裂解，證明 MSC-Ex

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本文編號：2757325