【摘要】：研究目的:糖尿病性視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy,DR)是常見(jiàn)的致盲性糖尿病相關(guān)微血管病變。環(huán)狀RNA(Circular RNA,circRNAs)是一組參與多種生理和病理過(guò)程的非編碼RNA。本研究擬運(yùn)用circRNAs微陣列芯片分析技術(shù),觀察DR模型動(dòng)物視網(wǎng)膜組織中circRNAs的表達(dá)特征,并通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)探究其在糖尿病性視網(wǎng)膜微血管病變中的調(diào)控作用,為DR的治療提供新思路。研究方法:1.利用circRNAs微陣列芯片篩查DR模型小鼠視網(wǎng)膜組織中差異性表達(dá)的circRNAs,通過(guò)qRT-PCR隨機(jī)驗(yàn)證20條表達(dá)上調(diào)和20條表達(dá)下調(diào)超過(guò)3倍的circRNAs,篩選表達(dá)上調(diào)最顯著的環(huán)狀RNA-PWWP2A并驗(yàn)證其在DR模型小鼠視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)規(guī)律。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)上調(diào)或下調(diào)DR模型小鼠視網(wǎng)膜組織中cPWWP2A的表達(dá)量,利用Evans Blue熒光滲漏實(shí)驗(yàn)、ELISA法、視網(wǎng)膜平鋪片免疫熒光染色法和胰酶消化視網(wǎng)膜平鋪片聯(lián)合PAS染色法明確cPWWP2A在DR微血管病變中的調(diào)控作用。3.體外實(shí)驗(yàn)中,利用cPWWP2A siRNA使周細(xì)胞內(nèi)cPWWP2A表達(dá)降低,通過(guò)細(xì)胞免疫熒光法、Ki67細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、PI熒光染色和Caspase 3/7活性檢測(cè)研究cPWWP2A表達(dá)量改變對(duì)周細(xì)胞功能的影響;血管生成聯(lián)合CD31/NG2細(xì)胞免疫熒光染色法和血管內(nèi)皮細(xì)胞功能屏障實(shí)驗(yàn)研究周細(xì)胞內(nèi)cPWWP2A表達(dá)降低后對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響。4.通過(guò)生物信息分析、RNA熒光原位雜交技術(shù)(RNA Fluorscence In Situ Hybridization,RNA-FISH)、雙熒光素酶基因報(bào)告和RNA-Pulldown實(shí)驗(yàn)明確cPWWP2A與miR-579的靶向結(jié)合。并在體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)中通過(guò)改變cPWWP2A/miR-579表達(dá)量,利用視網(wǎng)膜平鋪片免疫熒光染色法、胰酶消化視網(wǎng)膜平鋪片聯(lián)合PAS染色法、Evans Blue熒光滲漏實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞免疫熒光法、Ki67細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、PI熒光染色和Caspase 3/7活性檢測(cè)研究cPWWP2A/miR-579表達(dá)對(duì)視網(wǎng)膜微血管病變和周細(xì)胞功能的影響。運(yùn)用雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)分析miR-579對(duì)血管生成素1(Angiopoietin 1,Ang 1)、Occludin和沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶l(Silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT 1)的靶向作用。研究結(jié)果:1.circRNAs微陣列芯片篩查共發(fā)現(xiàn)884種circRNAs的表達(dá)較正常對(duì)照組有明顯的差異,其中有433種circRNAs表達(dá)上調(diào),411種circRNAs表達(dá)下調(diào)。對(duì)于隨機(jī)挑選的circRNAs進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)分別有14個(gè)表達(dá)上調(diào)和16個(gè)表達(dá)下調(diào)的circRNAs變化趨勢(shì)與微陣列分析結(jié)果一致。其中有3條circRNAs表達(dá)顯著上調(diào),比較同源序列的概率后選擇環(huán)狀RNA PWWP2A作為本研究的靶點(diǎn)。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,沉默DR模型小鼠視網(wǎng)膜組織中cPWWP2A的表達(dá)后,Evans Blue熒光滲漏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)血管滲漏明顯增加;ELISA法檢測(cè)白介素(Interleukin,IL)-2、IL-6、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor,TNF-α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial factor,VEGF)和人單核細(xì)胞趨化因子(Human monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)含量均增高;視網(wǎng)膜平鋪片免疫熒光染色顯示周細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物NG2表達(dá)量減少;胰酶消化視網(wǎng)膜血管平鋪片聯(lián)合PAS糖原染色結(jié)果顯示異常形態(tài)的血管數(shù)量增多。而過(guò)表達(dá)cPWWP2A后,通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜血管管壁滲漏減少、周細(xì)胞在視網(wǎng)膜血管網(wǎng)的覆蓋率增大且異常形態(tài)的血管數(shù)量減少。3.體外實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)敲低周細(xì)胞內(nèi)cPWWP2A的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)周細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物表達(dá)水平明顯下降;Ki67細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)增殖信號(hào)明顯減少;PI熒光染色和Caspase 3/7活性檢測(cè)周細(xì)胞凋亡水平升高;血管生成實(shí)驗(yàn)及CD31/NG2免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)周細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的趨附力減弱;內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能檢查中發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞間屏障被破壞。4.分子機(jī)制研究中,首先通過(guò)RNA-FISH、雙熒光素酶基因報(bào)告和RNA-Pulldown實(shí)驗(yàn)明確了cPWWP2A與miR-579共表達(dá)于胞質(zhì)并可互相結(jié)合。其次,在體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)中過(guò)表達(dá)miRNA-579后發(fā)現(xiàn)周細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)降低;Ki67細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)周細(xì)胞增殖力降低;PI染色和Caspase 3/7活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)周細(xì)胞的凋亡水平增高;血管生成及CD31/NG2免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)周細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的趨附力減弱。而共轉(zhuǎn)染miRNA-579和cPWWP2A后,細(xì)胞增殖力較單獨(dú)轉(zhuǎn)染miRNA-579組明顯增高、凋亡水平明顯下降及周細(xì)胞趨附力減弱。而拮抗miR-579表達(dá)后,上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象均明顯改善。最后,通過(guò)雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)明確了Ang 1、Occludin和SIRT 1是cPWWP2A/miR-579調(diào)控軸的下游靶基因。研究結(jié)論:1.本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),cPWWP2A與DR具有明顯相關(guān)性。在體內(nèi)、外高糖環(huán)境下,cPWWP2A的表達(dá)水平均顯著上調(diào)。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,cPWWP2A表達(dá)沉默加重了糖尿病性視網(wǎng)膜微血管病變的過(guò)程。3.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,cPWWP2A表達(dá)沉默加重了周細(xì)胞功能的損傷,并導(dǎo)致周細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞間Crosstalk的異常。4.cPWWP2A通過(guò)海綿樣吸附miRNA-579以發(fā)揮ceRNA的作用,導(dǎo)致下游靶基因Angiopoietin 1/Occludin/SIRT 1表達(dá)的增加,進(jìn)而參與調(diào)控周細(xì)胞功能及周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間Crosstalk。
【圖文】：

南京醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文降解，，而 cPWWP2A 不易被該酶所降解(見(jiàn)圖 1.4)，進(jìn)一步驗(yàn)證了 cPWWP2A 符合 circRNAs 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并較線性 RNA 分子具有明顯的穩(wěn)定性。接著，為了研究 cPWWP2A 與 DR 間的相關(guān)性，通過(guò) qRT-PCR 法對(duì) STZ誘導(dǎo)的 DR 模型小鼠和正常對(duì)照組小鼠的視網(wǎng)膜組織中 cPWWP2A 的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在注射 STZ 后持續(xù)高血糖 2 個(gè)月、4 個(gè)月和 6 個(gè)月的視網(wǎng)膜組織中，cPWWP2A 的表達(dá)量要明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，且隨高糖持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增高。使用胰島素干預(yù)治療后，DR 模型小鼠視網(wǎng)膜組織中的cPWWP2A 表達(dá)量要明顯低于未治療組，但仍高于正常對(duì)照組(見(jiàn)圖 1.5 A)。在自發(fā)性糖尿病模型小鼠即 db/db 小鼠視網(wǎng)膜組織中，cPWWP2A 的表達(dá)量也明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，而胰島素干預(yù)治療組中 cPWWP2A 的表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯降低(見(jiàn)圖 1.5 B)。

量要明顯低于未治療組，但仍高于正常對(duì)照組型小鼠即 db/db 小鼠視網(wǎng)膜組織中，cPWWP2(P＜0.05)，而胰島素干預(yù)治療組中 cPWWP2(見(jiàn)圖 1.5 B)。于視網(wǎng)膜組織中的cPWWP2A運(yùn)用Sanger法測(cè)序的結(jié)A 的堿基序列(下列)與 circBase 數(shù)據(jù)庫(kù)中序列(上列)
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R587.2;R774.1

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本文編號(hào)：2656817