【摘要】：背景:調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)是具有負(fù)向免疫調(diào)控作用的T淋巴細(xì)胞,在建立與維持移植耐受等方面起關(guān)鍵作用。但目前有關(guān)角膜移植免疫排斥過程中Tregs功能變化的規(guī)律尚不十分明確。目的:本課題主要研究角膜移植免疫排斥過程中Tregs表型及功能的變化規(guī)律,在此基礎(chǔ)上探討角膜移植免疫排斥微環(huán)境影響Tregs表型與功能的機制,以期為臨床角膜移植免疫排斥反應(yīng)的多元化防治提供理論依據(jù)。方法:(1)角膜移植免疫排斥過程中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)目及功能的變化通過構(gòu)建小鼠穿透性角膜移植模型,在此基礎(chǔ)上研究角膜移植免疫排斥過程中Tregs數(shù)目及功能的變化情況:(1)Tregs數(shù)目變化的檢測:制備眼前節(jié)單細(xì)胞懸液,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測角膜移植免疫排斥過程中Treg細(xì)胞的相對含量;(2)Treg細(xì)胞中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3(Forkhead box protein P3)表達(dá)水平分析:分離發(fā)生免疫排斥小鼠的眼前節(jié)組織,并通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)及流式細(xì)胞術(shù)檢測角膜移植免疫排斥過程中Foxp3的表達(dá)水平;(3)Tregs免疫抑制功能評估:利用角膜移植免疫排斥小鼠的眼前節(jié)上清液模擬角膜移植免疫排斥微環(huán)境,通過Tregs與效應(yīng)T細(xì)胞(effector T cells,Teffs)共培養(yǎng)實驗,研究Treg細(xì)胞對Teffs增殖的影響,進(jìn)而評估免疫排斥過程中Treg細(xì)胞功能的改變。(2)角膜移植免疫排斥微環(huán)境影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能的機制分別采用免疫磁珠法分選BALB/c小鼠脾臟中的Tregs及Teffs,然后采用Tregs與Teffs體外共培養(yǎng)模型,探討角膜移植免疫排斥微環(huán)境影響Tregs功能的機制:(1)利用蛋白免疫印跡(western blot,WB)及流式細(xì)胞術(shù)檢測角膜移植免疫排斥微環(huán)境對Tregs中天冬氨酸特異酶切的半胱氨酸蛋白酶-8(cysteine-dependent aspartyl-specific protease-8,caspase-8)及Foxp3表達(dá)水平的影響;(2)利用小分子化合物抑制caspase-8活性,通過體外共培養(yǎng)實驗研究Tregs對Teffs增殖的影響,進(jìn)而評估caspase-8對Tregs免疫抑制功能的影響;(3)利用WB分析抑制caspase-8活性后Treg細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)水平。(3)腫瘤壞死因子-α中和性抗體對角膜移植免疫排斥過程中Foxp3及caspase-8表達(dá)的影響構(gòu)建小鼠穿透性角膜移植模型,并通過結(jié)膜下注射腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)中和性抗體評估其對角膜移植免疫排斥反應(yīng)的影響:(1)裂隙燈顯微鏡觀察角膜植片透明情況,記錄角膜植片生存時間并采用Kaplan-Meier方法繪制角膜生存曲線;(2)利用免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)及q RT-PCR評估角膜植片的病理改變情況;(3)采用WB分析干預(yù)治療后角膜植片中Foxp3及caspase-8表達(dá)水平的變化。(4)阻斷Caspase-8活性對角膜移植免疫排斥反應(yīng)的影響構(gòu)建穿透性小鼠角膜移植模型,通過結(jié)膜下注射caspase-8抑制劑,評估其對角膜移植免疫排斥反應(yīng)的影響:(1)裂隙燈顯微鏡觀察并記錄角膜植片存活狀態(tài),并應(yīng)用Kaplan-Meier方法進(jìn)行統(tǒng)計分析;(2)通過蘇木素-伊紅染色(hematoxylin and eosin,HE)以及q RT-PCR分析caspase-8抑制劑對角膜植片病理改變的影響;(3)采用免疫熒光以及WB等技術(shù)檢測角膜植片中caspase-8活性以及Foxp3表達(dá)水平的變化。結(jié)果:(1)角膜移植免疫排斥微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相對含量增多,但其免疫抑制功能受損與同系角膜移植組相比,異系角膜移植組免疫排斥眼前節(jié)中Tregs的相對含量顯著增多;進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Tregs中Foxp3轉(zhuǎn)錄水平增多,但蛋白水平減少;體外共培養(yǎng)實驗結(jié)果表明:角膜移植免疫排斥微環(huán)境中Tregs的免疫抑制功能受損,但中和免疫排斥微環(huán)境中TNF-α可恢復(fù)Tregs的免疫抑制功能。(2)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫抑制功能受損與Caspase-8表達(dá)上調(diào)有關(guān)通過WB及流式細(xì)胞術(shù)研究發(fā)現(xiàn):角膜移植免疫排斥眼前節(jié)上清液預(yù)處理Tregs后,其細(xì)胞中的Foxp3蛋白水平明顯降低、而活化形式的caspase-8顯著增加,提示caspase-8可能與Treg細(xì)胞免疫抑制功能的改變有關(guān);進(jìn)一步通過體外實驗發(fā)現(xiàn):抑制caspase-8活性不僅可以補救Treg細(xì)胞的免疫抑制功能,還能恢復(fù)Foxp3的表達(dá)。(3)TNF-α中和性抗體治療可明顯延緩角膜移植免疫排斥反應(yīng)免疫熒光以及ELISA的結(jié)果顯示:免疫排斥過程中,眼內(nèi)TNF-α的水平明顯增加;體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn):中和TNF-α不僅可以有效延長角膜植片的存活時間,還能明顯減輕角膜移植術(shù)后的炎癥反應(yīng);通過WB進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),經(jīng)TNF-α中和性抗體治療后,角膜植片中caspase-8水平下降、Foxp3水平增加,提示TNF-α中和性抗體可能通過改善Treg細(xì)胞的免疫抑制功能發(fā)揮其抗免疫排斥效果。(4)阻斷Caspase-8活性可顯著延長角膜植片存活通過q RT-PCR、免疫熒光及WB等技術(shù)發(fā)現(xiàn):免疫排斥的角膜植片不僅高表達(dá)caspase-8,并且活化形式的caspase-8的水平也明顯增加;與未治療組相比,caspase-8抑制劑治療組角膜植片透明,炎細(xì)胞浸潤及炎性細(xì)胞因子表達(dá)明顯減少,角膜植片存活時間延長;通過WB進(jìn)一步發(fā)現(xiàn):經(jīng)caspase-8抑制劑干預(yù)治療后Foxp3蛋白水平明顯增加,提示caspase-8抑制劑抗免疫排斥效果可能與增強Treg細(xì)胞免疫抑制功能有關(guān)。結(jié)論:(1)角膜移植術(shù)后發(fā)生免疫排斥時,其前房微環(huán)境導(dǎo)致眼內(nèi)組織中的Tregs免疫抑制功能缺陷。(2)角膜移植發(fā)生免疫排斥時術(shù)后微環(huán)境的變化,主要是通過增強Treg細(xì)胞中caspase-8活性降低Foxp3蛋白穩(wěn)定性,進(jìn)而破壞Treg細(xì)胞的免疫抑制功能。(3)TNF-α中和性抗體及caspase-8抑制劑均可顯著延緩角膜移植免疫排斥反應(yīng),在機制上可能與增強Foxp3的穩(wěn)定性有關(guān)。
【圖文】：

第二章 結(jié) 果植免疫排斥微環(huán)境調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞數(shù)目及功能的改變透性角膜移植模型的建立及觀察燈觀察有無角膜水腫，新生血管生長情況，前房內(nèi)的變化以及有膜移植免疫排斥反應(yīng)發(fā)生時間。結(jié)果顯示：同系角膜移植組未植片透明；異系角膜移植組角膜于術(shù)后 2～3 周發(fā)生免疫排斥濁顯著，，伴新生血管長入角膜植片，眼前房結(jié)構(gòu)不可見（圖 1）性角膜移植模型構(gòu)建成功,為后續(xù)實驗的開展奠定基礎(chǔ)。

植眼前節(jié)調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞相對含量眼前節(jié) Tregs 相對含量顯著多于同微環(huán)境中調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞表轉(zhuǎn)錄因子，不僅在 Tregs 的增面起重要作用。Foxp3 通過的免疫抑制功能[31]。我們通過s Foxp3 的表達(dá)情況。qRT-PC排斥角膜植片中 Foxp3 的轉(zhuǎn)p3 蛋白的表達(dá)水平顯著減少疫抑制功能存在缺陷。
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R779.65

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本文編號：2649616