【摘要】：真菌性角膜炎是一種世界范圍內(nèi)廣泛流行、較頑固、可致盲的真菌感染，常伴有角膜潰瘍、化膿性感染及視力受損，嚴重影響患者的健康和生活質(zhì)量。近年來，真菌性角膜炎發(fā)病率顯著增加，其原因主要與植物性角膜外傷、慢性眼表性疾病、眼科手術及角膜移植有關，廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素的濫用及隱形眼鏡的使用不當，及AIDS、糖尿病、系統(tǒng)性免疫缺陷病等免疫低下人群的增加也提高了真菌性角膜炎的發(fā)病率。 真菌性角膜炎發(fā)病隱匿，感染進展迅速，早期診斷困難。臨床上，眼科常用抗真菌治療藥物較少，病原菌耐藥現(xiàn)象嚴重，有效治療困難。因此，了解真菌性角膜炎的常見臨床表現(xiàn)、易感因素、高發(fā)年齡及多發(fā)季節(jié)，掌握常見病原真菌種類及其藥物敏感性特點，建立快速、特異的鑒定技術，對該病的早期準確診斷、及時有效治療、控制感染及預后恢復具有重要意義。 眼部感染常用的診斷方法包括直接涂片鏡檢、真菌培養(yǎng)、共聚焦顯微鏡成像、血清學診斷及組織病理學檢查等。由于角膜刮片取材較困難、標本量少，真菌生長緩慢，導致檢出率較低、耗時長，且易造成角膜損傷，難以滿足臨床的需求。 近年來，以核酸為基礎的PCR及DNA測序技術逐步發(fā)展起來。因其反應迅速、敏感性強、特異性好，在臨床檢測方面應用前景廣闊。目前，用于真菌性角膜炎的鑒定診斷及流行病學研究的PCR技術有巢式PCR、RFLP等。但由于尚缺乏合適的微量DNA的有效提取方法和重要病原真菌的特異性引物，使得臨床檢測仍多依賴于真菌培養(yǎng)。復合PCR技術作為一種新型PCR技術，因其可利用一個反應同時鑒定多種病原菌，且操作簡便、反應迅速、檢出率高，被廣泛應用于微生物和寄生蟲感染的診斷中。目前，國內(nèi)外利用該技術診斷真菌性角膜炎的報道甚少。 本研究在掌握吉林省真菌性角膜炎病原學特點及流行病學規(guī)律的基礎上，針對吉林省的優(yōu)勢病原菌設計種特異性引物，并結合改良的感染角膜組織DNA提取方法，利用復合PCR技術對臨床患者角膜刮片標本中的病原菌進行了快速鑒定。 1.真菌性角膜炎病原學及流行病學分析 本研究對2004年10月至2011年12月，采集吉林大學附屬醫(yī)院眼科疑似真菌性角膜炎患者的角膜刮片標本225例，進行了KOH濕片法、真菌分離培養(yǎng)、鑒定、藥物敏感性分析及流行病學調(diào)查。有208例患者確診為真菌性角膜炎。共分離獲得15屬、28種、168株病原真菌。以鐮刀菌屬最多見，其次是曲霉屬和假絲酵母屬；優(yōu)勢病原菌種為茄病鐮刀菌、煙曲霉及光滑假絲酵母。 統(tǒng)計結果顯示，吉林省真菌性角膜炎在秋冬季發(fā)病率較高�；颊邅碜约质「鱾€地區(qū)，男女患者比例為1.5:1，平均年齡為50.1±12.5歲，農(nóng)民占大多數(shù)，。角膜外傷是最常見的易感因素。半數(shù)以上的患者有局部抗生素、糖皮質(zhì)激素、抗真菌藥治療史。藥物敏感性試驗表明，28株受試的茄病鐮刀菌對納他霉素（敏感性達100%）、伏立康唑及兩性霉素B的敏感性較高，而對伊曲康唑不敏感；12株煙曲霉和10株光滑假絲酵母對伊曲康唑、伏立康唑及納他霉素的敏感性均可達100%，而對兩性霉素B的敏感性分別為50%和80%。提示納他霉素可作為臨床預防和治療真菌性角膜炎的首選藥物。 2.優(yōu)勢病原菌種的復合PCR鑒定技術 本研究利用真菌線粒體細胞色素b基因通用引物，擴增獲得了真菌性角膜炎常見病原菌及環(huán)境真菌的DNA序列，同源性比對分析，尋找3種吉林省真菌性角膜炎優(yōu)勢病原菌種茄病鐮刀菌、煙曲霉及光滑假絲酵母的特異性位點，設計了3對種特異性引物，建立并優(yōu)化了復合PCR鑒定技術。茄病鐮刀菌、煙曲霉及光滑假絲酵母可分別產(chǎn)生約320bp、270bp及230bp的特異性條帶，其它種屬真菌、常見病原細菌及正常角膜組織均未見擴增，表明設計的引物具有良好的種內(nèi)通用性和種間特異性。該反應體系的敏感性可達到50pg級。利用該技術，對研究中一些形態(tài)學鑒定困難或鑒定有誤的菌株進行了重新鑒定和分類。 3.真菌性角膜炎患者標本的快速檢測 本研究利用角膜基質(zhì)注射法，建立了豚鼠鐮刀菌性角膜炎模型，經(jīng)真菌培養(yǎng)和組織病理學檢查驗證，有90%建模成功。建立了改良的感染角膜組織DNA的提取方法。并利用該方法提取了42例疑似真菌性角膜炎患者的角膜刮片標本DNA，進行了PCR檢測。PCR檢測陽性率（88%）高于真菌培養(yǎng)法，具有統(tǒng)計學意義。利用建立的復合PCR技術對主要病原菌種進行了鑒定。與傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)（需要1~2周）相比，該非培養(yǎng)技術具有快速、特異性高的特點，可在4~8h內(nèi)迅速判斷有無真菌感染、單一或混合感染及何種真菌感染。 綜上所述，本研究分析了吉林省真菌性角膜炎的病原學特點及流行病學規(guī)律，為臨床的診治積累了有用資料；建立了改良的豚鼠鐮刀菌性角膜炎角膜刮片DNA提取方法，針對吉林省的優(yōu)勢病原菌種自主設計了3對種特異性引物，利用復合PCR技術對臨床患者角膜刮片標本中的病原菌進行了快速鑒定，并證明其特異性高、敏感性好、檢出率高，，實現(xiàn)了真菌性角膜炎的非培養(yǎng)快速診斷，為臨床推廣應用奠定了理論基礎和技術支撐。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R772.21

【參考文獻】

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1 史偉云,李紹偉,謝立信;板層角膜移植術治療真菌性角膜炎的臨床療效分析[J];中華眼科雜志;2002年06期

2 姬亞洲,張東魁,張承立;真菌性角膜炎的病理學研究[J];中國實用眼科雜志;2005年09期

3 王麗婭!450003鄭州,張月琴!450003鄭州,王印其!450003鄭州,王剛生,盧嘉彪,鄧潔華;中國三地區(qū)真菌性角膜病致病菌種的調(diào)查[J];中華眼科雜志;2000年02期

本文編號：2568540