【摘要】：[目的] 1.采用MTT比色法來(lái)檢測(cè)益氣解毒方不同有效部位對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE2的抑瘤作用,初步篩選該方抗鼻咽癌的有效部位。 2.觀察益氣解毒方乙酸乙酯提取物(EAE)對(duì)荷鼻咽癌細(xì)胞移植瘤裸鼠的抑瘤效率及其對(duì)腫瘤微環(huán)境DC功能相關(guān)細(xì)胞因子分泌活性的影響,進(jìn)一步確定益氣解毒方乙酸乙酯提取物干預(yù)鼻咽癌腫瘤微環(huán)境DC的藥學(xué)效應(yīng)。 3.觀察益氣解毒方有效部位乙酸乙酯提取物對(duì)鼻咽癌患者外周血樹(shù)突狀細(xì)胞分化發(fā)育及T細(xì)胞活化的干預(yù)效應(yīng),確定該提取物對(duì)鼻咽癌患者DC相關(guān)抗腫瘤免疫病理學(xué)學(xué)的影響。 [方法] 第一部分益氣解毒方不同極性部位的提取及其抗鼻咽癌活性的研究 采用不同的溶劑將益氣解毒方分離為不同的極性部位,然后應(yīng)用MTT比色法測(cè)定該方各個(gè)提取部位的抑瘤效應(yīng)。 第二部分益氣解毒方乙酸乙酯提取物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞裸鼠移植瘤微環(huán)境DC相關(guān)免疫病理學(xué)的干預(yù)效應(yīng)研究 1.鼻咽癌CNE2細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng) 2.在BALB/c裸鼠制備CNE2細(xì)胞移植瘤模型 3.將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為四組：模型組、益氣解毒方乙酸乙酯提取物組(EAE組)、順鉑(DDP)組和聯(lián)合治療(EAE+DDP)組,干預(yù)處理12d后,期間觀察裸鼠的一般行為狀況的變化,然后處死裸鼠,獲取組織標(biāo)本,檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。 4.比較各組荷瘤裸鼠的抑瘤率。 5.用SABC免疫組化法檢測(cè)比較各組移植瘤組織中IL-12和MHC-Ⅱ的蛋白表達(dá)含量。 6.采用ELISA法檢測(cè)比較各組移植瘤組織中IL-4、IL-12和IFN-γ的水平含量。 7.運(yùn)用RT-PCR法檢測(cè)比較各組移植瘤組織中IL-4、IL-12和IFN-γ的基因表達(dá)水平。 第三部分益氣解毒方乙酸乙酯提取物對(duì)鼻咽癌患者外周血體外誘導(dǎo)之DC相關(guān)功能的干預(yù)效應(yīng)研究 1.無(wú)菌分離鼻咽癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),應(yīng)用重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重組人白介素-4(rhIL-4)體外誘導(dǎo)生成DC,同時(shí)在培養(yǎng)液中加入不同濃度的益氣解毒方乙酸乙酯提取物(100μg/ml,200μg/ml),并設(shè)立生理鹽水(NS)對(duì)照組,以觀察DC的形態(tài)特征及功能變化。 2.在DC培養(yǎng)的第7d,收集并調(diào)整細(xì)胞密度,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志物CDla、CD86和HLA-DR的表達(dá)情況。 3.收集每次換下的培養(yǎng)上清液,采用ELISA法檢測(cè)其中的細(xì)胞因子IL-12水平動(dòng)態(tài)變化。 4.應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)經(jīng)益氣解毒方EAE刺激后DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE2的殺傷效率 [結(jié)果] 第一部分益氣解毒方不同極性部位的提取及其抗鼻咽癌活性的研究 益氣解毒方經(jīng)溶劑提取法制備,獲得了多糖提取部位、乙酸乙酯提取部位和乙醇提取部位。多糖和乙醇提取部位無(wú)明顯的抑瘤作用；乙酸乙酯提取物在100μg/ml已具有明顯的抑瘤作用,且抑瘤率與藥物劑量呈明顯的正相關(guān)關(guān)系。 第二部分益氣解毒方乙酸乙酯提取物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞裸鼠移植瘤微環(huán)境DC相關(guān)免疫病理學(xué)的干預(yù)效應(yīng)研究 1.各處理組動(dòng)物的一般情況比較 模型動(dòng)物觀察過(guò)程中,精神狀態(tài)好,活動(dòng)自如,攝食和飲水正常、大小二便正常,期間無(wú)明顯不良反應(yīng)。EAE組裸鼠未見(jiàn)明顯的藥物毒副反應(yīng),精神狀態(tài)好,對(duì)刺激反應(yīng)明顯,生存質(zhì)量好；其次為聯(lián)合治療組；再次為模型組；DDP組藥物毒副反應(yīng)明顯,拱肩縮背、行動(dòng)緩慢、體態(tài)倦怠等表現(xiàn),生存質(zhì)量最差。 2.益氣解毒方有效部位EAE、DDP及聯(lián)合用藥都可以明顯提高荷瘤裸鼠的抑瘤率,但EAE聯(lián)合DDP對(duì)移植瘤具有更好的協(xié)同抑瘤作用。 3.免疫組化法檢測(cè)結(jié)果顯示：與模型對(duì)照組比較,EAE組、DDP組和聯(lián)合用藥組移植瘤組織中IL-12、MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)水平升高,差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著(P0.01)。與EAE組比較,DDP組中IL-12、MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)水平降低,而聯(lián)合用藥組中IL-12、MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 4.各組裸鼠移植瘤組織中IL-4、IL-12、IFN-γ水平含量比較 經(jīng)不同藥物對(duì)各組移植瘤模型進(jìn)行處理后,EAE組、DDP組和聯(lián)合治療組移植瘤組織勻漿上清液中IL-12、IFN-γ含量水平均增加,而IL-4含量水平降低,與模型組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。與EAE組比較,DDP組上清液中IL-12、IFN-γ水平含量水平降低,IL-4含量水平升高,聯(lián)合治療組上清液中IL-12、IFN-γ水平含量水平升高,IL-4含量水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。以上結(jié)果說(shuō)明,益氣解毒方乙酸乙酯提取物和DDP均能增加鼻咽癌細(xì)胞移植瘤微環(huán)境中IL-12、IFN-γ含量水平,降低IL-4含量水平,但益氣解毒方EAE單用的效果優(yōu)于DDP,而兩者聯(lián)合運(yùn)用則能更有較地調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞移植瘤微環(huán)境中Th1與Th2相關(guān)因子的含量水平變化趨勢(shì),有利于克服腫瘤微環(huán)境中的免疫耐受現(xiàn)象。 5.腫瘤組織IL-4、IL-12、IFN-γ基因表達(dá)水平比較 經(jīng)藥物干預(yù)后,與模型對(duì)照組比較,EAE組和聯(lián)合治療組中IL-12、IFN-γ基因表達(dá)水平增加,IL-4基因表達(dá)水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。EAE組與DDP組比較,IL-12、IFN-γ基因表達(dá)水平增加,IL-4基因表達(dá)水平降低；EAE組與聯(lián)合治療組相比,后者IL-12、IFN-γ基因表達(dá)水平增加,IL-4基因表達(dá)水平降低更加顯著,其差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。以上結(jié)果說(shuō)明益,氣解毒方乙酸乙酯提取物能增加IL-12、IFN-γ基因表達(dá)水平,降低IL-4的基因表達(dá)水平,其變化趨勢(shì)與鼻咽癌細(xì)胞移植瘤微環(huán)境中相應(yīng)細(xì)胞因子表達(dá)活性相似,能夠有效提高腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞免疫效應(yīng)機(jī)制,而且也提示聯(lián)合治療組效果更加顯著。 第三部分益氣解毒方乙酸乙酯提取物對(duì)體外誘導(dǎo)之鼻咽癌患者外周血DC相關(guān)功能的干預(yù)效應(yīng)研究 1.益氣解毒方EAE可以促進(jìn)體外誘導(dǎo)之鼻咽癌患者外周血DC分化及成熟,培養(yǎng)第1d后即可見(jiàn)大部分細(xì)胞貼壁,許多細(xì)胞聚集并均勻分散形成細(xì)胞集落。第2～3d可見(jiàn)細(xì)胞有少量短突起,部分細(xì)胞不規(guī)則,部分細(xì)胞開(kāi)始呈現(xiàn)半懸浮和懸浮狀態(tài)。第4d后高劑量組中可見(jiàn)大部分細(xì)胞有突起伸出交織在一起,低劑量和NS組有部分細(xì)胞伸出突起。第7d低、高劑量中的細(xì)胞變大變圓,大部分DC從貼壁變成懸浮狀態(tài),而NS組中的細(xì)胞密度較低,且懸浮的細(xì)胞也較少。 2.益氣解毒方EAE能增加DC表面CD1a、CD86和HLA-DR的表達(dá),高劑量組作用顯著,與對(duì)照組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)意義非常顯著(P0.01)。 3. ELISA法檢測(cè)第2d、第4d和第6d的培養(yǎng)上清液,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-12的含量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而升高。低濃度和高濃度益氣解毒方EAE組中IL-12濃度均比NS對(duì)照組明顯增高(P0.01)；與低濃度組相比,高濃度EAE組中IL-12濃度也明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 4.益氣解毒方EAE能促進(jìn)體外誘導(dǎo)之鼻咽癌患者外周血DC的成熟,提高DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)CNE2細(xì)胞的殺傷活性,具有劑量效應(yīng)關(guān)系,與NS對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 [結(jié)論] 1.乙酸乙酯提取部位為益氣解毒方抗鼻咽癌的有效部位； 2.益氣解毒方EAE對(duì)鼻咽癌細(xì)胞裸鼠移植瘤具有較強(qiáng)的抑瘤作用,聯(lián)合運(yùn)用順鉑能進(jìn)一步增強(qiáng)其抑瘤率,有效提高荷瘤裸鼠治療后的生存質(zhì)量。 3.益氣解毒方EAE聯(lián)合順鉑能有效提高免疫活性細(xì)胞MHC-Ⅱ、IL-12和IFN-y的含量及其基因表達(dá)水平,降低IL-4的含量及基因表達(dá)水平,促使腫瘤微環(huán)境中Th1/Th2系統(tǒng)分化活性向Th1方向漂移,從而有利于改善腫瘤微環(huán)境中免疫耐受現(xiàn)象,促進(jìn)抗腫瘤免疫效應(yīng)。 4.益氣解毒方EAE能有效刺激體外誘導(dǎo)之鼻咽癌患者外周血DC的分化成熟,增加DC表面的CD1a、CD86和HLA-DR的陽(yáng)性表達(dá)；促進(jìn)DC的IL-12分泌活性；經(jīng)益氣解毒方EAE激活的DC,能增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖反應(yīng),強(qiáng)化CTL對(duì)鼻咽癌靶細(xì)胞的殺傷活性。 5.益氣解毒方EAE可能通過(guò)調(diào)節(jié)鼻咽癌腫瘤微環(huán)境中DC的功能功能狀態(tài),提高其腫瘤抗原遞呈能力,從而促進(jìn)荷瘤機(jī)體對(duì)腫瘤發(fā)揮細(xì)胞免疫應(yīng)答。
【學(xué)位授予單位】：湖南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2564726