【摘要】：背景葡萄膜炎從狹義上是指累及眼部虹膜、睫狀體和脈絡(luò)膜的炎癥,從廣義上是指累及眼部葡萄膜、玻璃體、視網(wǎng)膜以及視網(wǎng)膜血管的炎癥[1]。根據(jù)解剖位置分類(lèi)可以分為前葡萄膜炎、中間葡萄膜炎、后葡萄膜炎和全葡萄膜炎4大類(lèi);根據(jù)病因可以分為感染性葡萄膜炎和非感染性葡萄膜炎;根據(jù)臨床和病理特征又可分為肉芽腫性葡萄膜炎和非肉芽腫性葡萄膜炎[2]。白塞氏病(Behcet’s disease)和Vogt-小柳原田綜合征(VKH syndrome)作為在我國(guó)最為普遍的葡萄膜炎類(lèi)型,其在葡萄膜炎患者中致盲率高達(dá)57%,Behcet’s病是一種以葡萄膜炎、口腔潰瘍、生殖器潰瘍以及多形性皮膚損害等為特征的多系統(tǒng)、多器官受累的疾病。Vogt-小柳原田綜合征則是以雙眼肉芽腫性葡萄膜炎為特征的自身免疫性疾病,常伴發(fā)腦膜刺激征、皮膚和毛發(fā)異常以及聽(tīng)覺(jué)功能障礙,臨床常表現(xiàn)為彌漫性脈絡(luò)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎以及神經(jīng)視網(wǎng)膜炎[3-7]。上述兩種疾病導(dǎo)致的葡萄膜炎累及組織廣泛、反復(fù)發(fā)作、復(fù)發(fā)頻度高,越復(fù)發(fā)炎癥越重,視功能損害越重,在臨床治療中較為棘手,從而導(dǎo)致患者的生活質(zhì)量較差[8-9]。現(xiàn)目前對(duì)于這兩種疾病病因以及發(fā)病機(jī)制的研究均尚不完全清楚,現(xiàn)階段研究顯示Behcet’s病發(fā)病與多種細(xì)菌、病毒感染以及自身免疫反應(yīng)有較強(qiáng)關(guān)聯(lián),而vogt-小柳原田綜合征除了病毒感染以及自身免疫因素還可能與免疫遺傳因素相關(guān)。自身免疫性因素是現(xiàn)目前普遍接受的一種學(xué)說(shuō),其中對(duì)于cd4+t細(xì)胞以及相關(guān)免疫因子包括il-17、ifn-γ等的研究較多[10-16]。nod樣受體(nod-likereceptors,nlrs)作為一類(lèi)新型模式識(shí)別受體能夠與病原微生物結(jié)合從而激活機(jī)體的免疫防御機(jī)制,與其他模式受體諸如toll樣受體(tolllikereceptors,tlrs)共同形成自身免疫的首要防線(xiàn)[17-20]。近期越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)nod樣受體家族中的nod1和nod2受體在自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用,如對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞(dentriticcell,dc)等抗原提呈細(xì)胞以及相關(guān)免疫因子有顯著的調(diào)節(jié)作用[21-23]。因此我們進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):1.nod1與nod2受體在vogt-小柳原田綜合征和behcet’s病患者中表達(dá)水平的研究;3.nod1與nod2受體對(duì)pbmc功能的影響;4.nod1與nod2受體對(duì)dc功能的影響;5.nod1與nod2受體對(duì)cd4+t細(xì)胞功能的影響。從而以nod1和nod2受體為切入點(diǎn)研究?jī)深?lèi)受體是否參與到behcet’s病和vogt-小柳原田綜合征的發(fā)病機(jī)制,從而為這兩類(lèi)棘手的致盲性眼病的治療尋找到重要的靶分子和突破口。第一部分nod1與nod2受體在behcet’s病與vogt-小柳原田綜合征患者中mrna表達(dá)水平的研究目的:研究nod1與nod2受體在behcet’s病與vogt-小柳原田綜合征患者中mrna表達(dá)水平及與兩種疾病活動(dòng)的相關(guān)性。方法:抽取vogt-小柳原田綜合征患者(包括疾病活動(dòng)程度為活動(dòng)期和靜止期的患者)、behcet’s病患者(包括疾病活動(dòng)程度為活動(dòng)期和靜止期的患者)以及正常人的靜脈外周血利用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells,pbmcs)并提取pbmcs的rna反轉(zhuǎn)錄成cdna,采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr(rt-qpcr)法探討pbmcs中nod1與nod2受體的表達(dá)。結(jié)果:1.活動(dòng)期vogt-小柳原田綜合征患者nod1與nod2受體在pbmcs中mrna水平的表達(dá)均顯著高于正常人。2.靜止期vogt-小柳原田綜合征患者nod1與nod2受體在pbmcs中mrna水平的表達(dá)與正常人無(wú)明顯差異。3.活動(dòng)期behcet’s病患者nod1與nod2受體在pbmcs中mrna水平的表達(dá)與正常人無(wú)明顯差異。4.靜止期behcet’s病患者nod1與nod2受體在pbmcs中mrna水平的表達(dá)與正常人無(wú)明顯差異。結(jié)論:我們的研究表明:nod1與nod2受體在活動(dòng)期vkh患者pbmcs中的mrna表達(dá)均顯著高于正常人,而在疾病靜止期與正常人之間卻無(wú)明顯差異,說(shuō)明nod1與nod2受體的mrna表達(dá)與vkh疾病的發(fā)生發(fā)展明顯相關(guān),活動(dòng)期與靜止期behcet’s病葡萄膜炎患者pbmcs中nod1與nod2受體的mrna表達(dá)與正常人無(wú)明顯差異,說(shuō)明nod1與nod2受體的mrna表達(dá)與bd發(fā)病機(jī)制無(wú)明顯相關(guān)。第二部分nod1與nod2受體在behcet’s病與vogt-小柳原田綜合征患者中蛋白表達(dá)水平的研究目的:研究nod1與nod2受體在behcet’s病與vogt-小柳原田綜合征患者中蛋白表達(dá)水平及其與疾病活動(dòng)的相關(guān)性方法:抽取vogt-小柳原田綜合征患者(包括疾病活動(dòng)程度為活動(dòng)期和靜止期的患者)、behcet’s病患者(包括疾病活動(dòng)程度為活動(dòng)期和靜止期的患者)及正常人靜脈外周血利用密度梯度離心分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells,pbmcs)。對(duì)分離出的pbmcs使用細(xì)胞裂解法提取總蛋白,然后使用免疫印跡試驗(yàn)(westernblot,wb)檢測(cè)正常人及病人pbmcs中nod1與nod2受體的表達(dá)。結(jié)果:1.活動(dòng)期vogt-小柳原田綜合征患者nod1與nod2受體在pbmcs中蛋白水平的表達(dá)均顯著高于正常人。2.活動(dòng)期behcet’s病患者nod1與nod2受體在pbmcs中蛋白水平的表達(dá)與正常人無(wú)明顯差異。結(jié)論:我們的研究表明:活動(dòng)期vogt-小柳原田綜合征患者pbmcs中nod1與nod2受體的蛋白表達(dá)均顯著高于正常人,在靜止期則不然,進(jìn)一步驗(yàn)證了nod1與nod2受體的表達(dá)與vkh疾病的發(fā)生發(fā)展明顯相關(guān),活動(dòng)期與靜止期behcet’s病葡萄膜炎患者pbmcs中nod1與nod2受體的蛋白表達(dá)與正常人無(wú)明顯差異,進(jìn)一步驗(yàn)證了nod1與nod2受體的表達(dá)與bd發(fā)病機(jī)制無(wú)明顯相關(guān)。第三部分:nod1與nod2受體對(duì)vogt-小柳原田綜合征患者與正常人pbmc功能的影響目的:研究nod1與nod2受體對(duì)vogt-小柳原田綜合征患者與正常人pbmcs產(chǎn)生炎癥因子的影響。方法:將從正常人和患者(活動(dòng)期vogt-小柳原田綜合征患者)靜脈新鮮抽取的外周血進(jìn)行密度梯度離心,以分離pbmcs進(jìn)行培養(yǎng)。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)的方法檢測(cè)nod1與nod2受體在相應(yīng)配體激活后對(duì)pbmcs功能的影響。結(jié)果:1.激活nod1與nod2受體后可以促進(jìn)vogt-小柳原田綜合征患者以及正常人炎癥因子il-6、il-1β、tnf-α的分泌。2.激活nod1與nod2受體后vogt-小柳原田綜合征患者炎癥因子il-6、il-1β、tnf-α的分泌水平顯著高于正常人。結(jié)論:結(jié)果表明,nod1與nod2受體在相應(yīng)配體激活后可以明顯促進(jìn)pbmcs中促炎因子il-6、il-1β、tnf-α的分泌,且vogt-小柳原田綜合征患者中炎癥因子的分泌水平顯著高于正常人,也印證了vogt-小柳原田綜合征患者與正常人相比其炎癥細(xì)胞的活動(dòng)性。第四部分:nod1與nod2受體對(duì)dc功能的影響目的:探討n(yōu)od1與nod2受體對(duì)vogt-小柳原田綜合征患者與正常人dcs表面標(biāo)志以及炎癥因子分泌水平的影響方法:將從正常人和患者(活動(dòng)期vogt-小柳原田綜合征患者)靜脈新鮮抽取的外周血進(jìn)行密度梯度離心,以分離pbmcs。用人cd14+t細(xì)胞磁珠進(jìn)行細(xì)胞分選培養(yǎng),收集cd14+t細(xì)胞,用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)和elisa的方法檢測(cè)nod1與nod2受體的激活對(duì)dcs成熟和功能的影響。結(jié)果:1.激活nod1與nod2受體后可以促進(jìn)vogt-小柳原田綜合征患者以及正常人dcs表面標(biāo)志cd40、cd80、cd83、cd86、hla-dr的表達(dá)。2.激活nod1與nod2受體后可以促進(jìn)vogt-小柳原田綜合征患者以及正常人dcs炎癥因子il-6、il-1β、tnf-α的分泌。3.激活nod1與nod2受體后vogt-小柳原田綜合征患者dcs炎癥因子il-6、il-1β的分泌水平顯著高于正常人。結(jié)論結(jié)果表明,nod1與nod2受體的激活可以明顯促進(jìn)dcs表面標(biāo)志的成熟以及炎癥因子的分泌,表明了nod1與nod2受體與固有免疫的重要關(guān)聯(lián),也進(jìn)一步印證了NOD1與NOD2受體與Vogt-小柳原田綜合征發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。第五部分:NOD1與NOD2受體對(duì)CD4+T細(xì)胞功能的影響目的:研究NOD1與NOD2受體通過(guò)DCs對(duì)CD4+T細(xì)胞的影響方法:將從正常人和患者(活動(dòng)期Vogt-小柳原田綜合征患者)靜脈新鮮抽取的外周血進(jìn)行密度梯度離心,以分離PBMCs。用人CD4+T細(xì)胞、CD14+T細(xì)胞磁珠進(jìn)行細(xì)胞分選共培養(yǎng),收集CD4+T細(xì)胞,用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)和ELISA的方法檢測(cè)NOD1與NOD2受體的激活對(duì)CD4+T功能的影響。結(jié)果:1.激活NOD1與NOD2受體后可以提高IL-17+、IFN-γ+Th細(xì)胞所占CD4+T細(xì)胞的百分比。2.激活NOD1與NOD2受體后可以促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分泌IL-17、IFN-γ。結(jié)論:結(jié)果表明,NOD1與NOD2的激活可以通過(guò)DCs促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的分化和成熟,從而進(jìn)一步揭示了NOD樣受體參與Vogt-小柳原田綜合征發(fā)病機(jī)制的作用通路。
【圖文】：

期 Behcet’t 病患者組，靜止期 Behcet’s 病患者組和健康對(duì)照組，用熒光R 的方法檢測(cè)每組中 NOD1 與 NOD2 mRNA 的表達(dá)，檢驗(yàn)方法用 Kruskal-Wt，，結(jié)果顯示，活動(dòng)期與靜止期 Behcet 病患者 NOD1 與 NOD2 受體在 PBMCNA 水平與正常人無(wú)明顯差異（圖 1 C, D）

正常人對(duì)照組，用免疫印跡方法檢測(cè)每組中 NOD1 與 NOD2 在 PBMCs 中蛋白水平的表達(dá)，以 β-actin 為參照，檢驗(yàn)方法用 One-way ANOVA, Kruskal-Wallis，Mann-Whitney U test，Bonferroni correction，結(jié)果顯示，活動(dòng)期 BD 病患者 NOD1與 NOD2 受體在 PBMCs 中蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異（圖 2A, B, C）。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R773.9

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本文編號(hào)：2564089