【摘要】：第一部分：耳蝸器官體外培養(yǎng)技術(shù)的建立 目的： 建立穩(wěn)定的新生小鼠耳蝸器官(Corti's Organ)的體外培養(yǎng)方法以及耳蝸毛細(xì)胞(hair cells)的組織學(xué)檢查技術(shù),為內(nèi)耳研究提供新的條件和模型。 方法： 在解剖顯微鏡下將出生后3-5天的小鼠基底膜完整的分離,用顯微剪分成底回、中回和頂回三個(gè)節(jié)段,利用培養(yǎng)液的表面張力使基底膜節(jié)段貼培養(yǎng)皿底壁平鋪培養(yǎng)。應(yīng)用熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽特異性染色標(biāo)記耳蝸毛細(xì)胞的靜纖毛和表皮板,熒光顯微鏡觀察。 結(jié)果： 耳蝸器官經(jīng)過24小時(shí)離體培養(yǎng)后,貼壁良好,外周可見明顯新生的上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞；經(jīng)過2-4天的離體培養(yǎng)后,外周新生細(xì)胞繼續(xù)增加,熒光顯微鏡觀察顯示毛細(xì)胞形態(tài)良好,纖毛排列整齊,成倒“V”字形。三排外毛細(xì)胞(OHC)和一排內(nèi)毛細(xì)胞(IHC)無(wú)缺失。表皮板連接緊密。內(nèi)毛細(xì)胞每100微米縱向長(zhǎng)度細(xì)胞個(gè)數(shù)為頂回8.92±0.665；中回10.67±0.606；底回11.58±0.585。外毛細(xì)胞每100微米縱向長(zhǎng)度細(xì)胞個(gè)數(shù)為頂回32.42±1.429；中回36.00±1.414；底回45.25±1.725。 結(jié)論： 組織貼壁法體外培養(yǎng)小鼠耳蝸器官是一種理想的觀察和評(píng)估耳蝸毛細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)造模方法。 第二部分：17-DMAG及硫酸卡那霉素分別對(duì)體外培養(yǎng)的耳蝸毛細(xì)胞的作用 目的： 研究抗炎及抗腫瘤藥物格爾德霉素的衍生物17-DMAG (17-(Dimeth y laminoethy lamino)-17-demethoxygeldanamycin)及硫酸卡那霉素兩種藥物對(duì)體外培養(yǎng)的耳蝸毛細(xì)胞的作用。 方法： 體外培養(yǎng)新生小鼠耳蝸器官24小時(shí)后加入不同劑量的上述兩種藥物,繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后,組織固定。用熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽特異性染色標(biāo)記耳蝸毛細(xì)胞的靜纖毛,熒光顯微鏡觀察。計(jì)數(shù)存活的毛細(xì)胞個(gè)數(shù)。 結(jié)果： 0.5μM,1μM,2μM及5μM濃度的17-DMAG對(duì)耳蝸毛細(xì)胞均沒有明顯的毒性作用。0.2mM,0.4mM,和1.0mM的卡那霉素對(duì)毛細(xì)胞均有不同程度的損傷,隨著卡那霉素濃度升高,毛細(xì)胞的損傷逐漸增加。外毛細(xì)胞的損傷程度大于內(nèi)毛細(xì)胞。底回毛細(xì)胞損傷最嚴(yán)重,中回次之,頂回毛細(xì)胞損傷較輕。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)利用體外培養(yǎng)的耳蝸器官研究上述兩種物質(zhì)分別對(duì)耳蝸毛細(xì)胞的作用,易于精確控制劑量,簡(jiǎn)單明確。本實(shí)驗(yàn)排除了17-DMAG對(duì)耳蝸毛細(xì)胞的毒性作用。且對(duì)進(jìn)一步研究毛細(xì)胞的保護(hù)作用提供了藥物劑量。 第三部分：17-DMAG誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的耳蝸毛細(xì)胞過表達(dá)HSP70蛋白并保護(hù)卡那霉素引起的毛細(xì)胞損傷 目的： 研究17-DMAG在體外培養(yǎng)的耳蝸毛細(xì)胞是否可以誘導(dǎo)HSP70過表達(dá)并保護(hù)卡那霉素引起的耳蝸毛細(xì)胞損傷。 方法： 選取2μM17-DMAG濃度,分為給藥組和空白對(duì)照組。利用漂浮培養(yǎng)法獲得足夠量的基底膜組織。利用實(shí)時(shí)定量PCR法和ELISA法檢測(cè)2.5小時(shí)、5小時(shí)、10小時(shí),以及24小時(shí)后HSP70在核酸和蛋白水平的表達(dá)量。利用熒光免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HSP70在基底膜的表達(dá)部位。選取2μM17-DMAG濃度和0.4mM卡那霉素濃度。分為空白對(duì)照組,卡那霉素組,和17-DMAG+卡那霉素組。利用鬼筆環(huán)肽特異性染色標(biāo)記耳蝸毛細(xì)胞的靜纖毛,熒光顯微鏡觀察。計(jì)數(shù)存活的毛細(xì)胞數(shù)量。 結(jié)果： 17-DMAG在體外培養(yǎng)的耳蝸毛細(xì)胞可以誘導(dǎo)HSP70過表達(dá),蛋白質(zhì)水平的表達(dá)增加晚于核酸水平,但維持時(shí)間更長(zhǎng)。且HSP70主要表達(dá)于內(nèi)、外毛細(xì)胞的胞漿內(nèi)。體外培養(yǎng)的耳蝸器官經(jīng)過17-DMAG預(yù)處理5小時(shí),再加入耳毒性卡那霉素,內(nèi)、外毛細(xì)胞存活量均顯著增加。17-DMAG能夠保護(hù)卡那霉素對(duì)毛細(xì)胞的損傷作用。 結(jié)論： 17-DMAG在體外培養(yǎng)的毛細(xì)胞可以誘導(dǎo)熱休克蛋白70的過表達(dá),并且顯著保護(hù)卡那霉素引起的毛細(xì)胞損傷。17-DMAG有潛力成為安全、有效的抗耳毒性藥物。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R764

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本文編號(hào)：2559873