【摘要】：第一部分 聯(lián)合應(yīng)用卡托普利和氨沙坦對(duì)肺炎鏈球菌所致的鼓室硬化的作用機(jī)制的研究目的鼓室硬化(Tympanosclerosis)是長(zhǎng)期慢性中耳炎愈合后所遺留的中耳結(jié)締組織退行性病變,是導(dǎo)致傳導(dǎo)性耳聾的重要原因之一。鼓室硬化的形成和發(fā)展可以對(duì)病人的正常交流造成影響,進(jìn)而降低病人的生活、學(xué)習(xí)和工作質(zhì)量,甚至還會(huì)影響病人的心理健康。但至今仍沒有有效的藥物來預(yù)防和治療鼓室硬化癥。近年來很多文獻(xiàn)對(duì)機(jī)體器官硬化的機(jī)制研究表明,發(fā)生在各組織和器官的硬化癥盡管在發(fā)生機(jī)制上有所差異,卻也有很多相似的特征�？ㄍ衅绽吐壬程故侵委煻喾N器官硬化的常用藥物,如動(dòng)脈硬化和腎硬化,卻從未應(yīng)用于治療鼓室硬化癥。在我們的實(shí)驗(yàn)中,通過中耳注射肺炎鏈球菌建立鼓室硬化的動(dòng)物模型,以此來研究卡托普利和氯沙坦聯(lián)合應(yīng)用對(duì)鼓室硬化有無治療作用以及可能的相關(guān)機(jī)制。方法1.實(shí)驗(yàn)分3組�？瞻讓�(duì)照組不做處理。應(yīng)用鼓膜穿刺術(shù)向右耳內(nèi)注射3型肺炎鏈球菌分別建立了豚鼠和大鼠的鼓室硬化的模型。然后根據(jù)是否使用卡托普利和氯沙坦進(jìn)而分為鼓室硬化組和用藥組。飼養(yǎng)6周。2.每周通過耳鏡觀察各組鼓膜鈣化的情況,以此從肉眼來判斷鼓室硬化的發(fā)展過程。3.6周后,聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response, ABR)分別檢測(cè)豚鼠和大鼠各組的聽力情況。ABR使用click聲進(jìn)行刺激,紀(jì)錄結(jié)果。4.ABR檢測(cè)完后,分別解剖出豚鼠和大鼠各組動(dòng)物的中耳鼓室黏膜組織。制作HE切片染色判斷中耳炎癥發(fā)生情況。von Kossa染色來判斷各組中耳鼓室黏膜鈣化的情況。5.免疫組化和Western blot從蛋白水平上檢測(cè)豚鼠和大鼠各組中耳鼓室黏膜TGF-β1表達(dá)含量的變化。6. RT-PCR從RNA水平上檢測(cè)大鼠中耳鼓室黏膜中TGF-β1表達(dá)含量的變化。結(jié)果1.耳鏡觀察結(jié)果顯示,聯(lián)合應(yīng)用卡托普利和氯沙坦在豚鼠和大鼠中都降低了鼓室硬化的發(fā)生率。正常對(duì)照組和未注射肺炎鏈球菌的左耳都未見異常。6周后豚鼠和大鼠鼓室硬化組鼓室硬化的發(fā)生率均為100%。用藥組右耳有不同程度的減輕。6周后,用藥組豚鼠組鼓室硬化的發(fā)生率降低為53%；用藥組大鼠組降低為63%。2.聽性腦干反應(yīng)結(jié)果顯示,用藥組相對(duì)于鼓室硬化組聯(lián)合應(yīng)用卡托普利和氯沙坦能部分恢復(fù)聽力功能。正常組聽力,豚鼠為10.25±1.17 dB,大鼠為7.75±0.85 dB；鼓室硬化組聽力,豚鼠為62.31±1.06 dB,大鼠為57±1.83dB；用藥組,豚鼠為36。39±1.41 dB,大鼠為35.5±1.92 dB。3.HE結(jié)果顯示,在第6周,豚鼠和大鼠鼓室硬化組的中耳鼓室黏膜均明顯增厚,有炎癥細(xì)胞和新生血管。在卡托普利和氯沙坦聯(lián)合用藥組,豚鼠和大鼠的中耳鼓室黏膜厚度、炎癥細(xì)胞和新生血管較鼓室硬化組均明顯降低。4. von Kossa染色結(jié)果顯示,鼓室硬化組中耳鼓室黏膜可見明顯的棕黃色深染的顆粒,說明有鈣化形成。而正常對(duì)照組沒有,用藥組較輕。5.免疫組化和Western blot結(jié)果顯示,豚鼠和大鼠的鼓室硬化組,中耳鼓室黏膜中TGF-β1的蛋白水平含量明顯升高,而用藥組有所降低。6. RT-PCR結(jié)果顯示,大鼠的鼓室硬化組中耳鼓室黏膜中TGF-β1的RNA水平含量明顯升高,而用藥組有所降低。結(jié)論聯(lián)合應(yīng)用卡托普利和氯沙坦可以改善肺炎鏈球菌引起的鼓室硬化過程,而這一作用可能是與降低TGF-β1的過表達(dá)有關(guān)。第二部分 螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的新型培養(yǎng)模式的建立目的在聽覺神經(jīng)系統(tǒng)中,螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是位于耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi)的初級(jí)聽覺傳入神經(jīng)元,它將耳蝸柯蒂氏器毛細(xì)胞感知到的聲音信息通過耳蝸神經(jīng)傳入到腦干聽覺中樞。螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷或繼發(fā)于毛細(xì)胞損傷后的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退化可以導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾。近年來關(guān)于神經(jīng)因子對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞雙極神經(jīng)突的再生的研究越來越熱。而這些體外實(shí)驗(yàn)的主要研究方法就是螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的原代體外培養(yǎng)。傳統(tǒng)的體外培養(yǎng)模式不能將螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞分開,而且2D的培養(yǎng)環(huán)境有很多固有的局限性,不能很好的體現(xiàn)體內(nèi)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞所在的內(nèi)環(huán)境。雖然3D培養(yǎng)被廣泛的用于了解組織的空間結(jié)構(gòu),但至今還沒有關(guān)于單純螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞體外3D培養(yǎng)的報(bào)道。在我們的研究中,我們用Bhlhb5cre和ROSA 26-td Tomato的老鼠交配得到Bhlhb5和ROSA 26-td Tomato雙陽性小鼠,并通過流式篩選得到純化的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,對(duì)其進(jìn)行3D體外培養(yǎng),并對(duì)其在神經(jīng)細(xì)胞形狀、軸突長(zhǎng)度和功能上與2D培養(yǎng)進(jìn)行分析和比較。方法1.用Bhlhb5cre和ROSA 26-td Tomato的老鼠交配,經(jīng)基因型鑒定得到Bhlhb5和ROSA 26-td Tomato雙陽性小鼠。2.選用P3-P5的乳鼠耳蝸解剖進(jìn)行基底膜鋪片和耳蝸切片,進(jìn)行免疫熒光染色,驗(yàn)證Tomato陽性細(xì)胞是否是螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。3.選用P3-P5的乳鼠耳蝸解剖得到蝸軸的細(xì)胞懸液,進(jìn)行流氏篩選,把Tomato陽性和陰性的細(xì)胞分別收集,以備后續(xù)使用。4.對(duì)篩選過的細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR和免疫熒光染色,來驗(yàn)證經(jīng)過流氏篩選Tomato陽性的細(xì)胞是否是神經(jīng)細(xì)胞。5.對(duì)流氏篩選過的Tomato陽性細(xì)胞分別進(jìn)行2D和3D培養(yǎng),并分別在培養(yǎng)后1 d、2d、3d、4d、5d、6d、7d,4%甲醛固定后進(jìn)行免疫熒光,對(duì)不同天數(shù)的神經(jīng)細(xì)胞在存活率、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞軸突個(gè)數(shù)和長(zhǎng)度進(jìn)行比較。結(jié)果1.基底膜鋪片和耳蝸切片免疫熒光結(jié)果顯示,體內(nèi)Tomato陽性的細(xì)胞和NF陽性的細(xì)胞共染。說明Tomato陽性的細(xì)胞是螺旋神經(jīng)細(xì)胞。2.免疫熒光的結(jié)果顯示,經(jīng)流氏篩選出的Tomato陽性細(xì)胞是和Tuj-1或Neun抗體共染,說明篩選出的陽性細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞；而篩選出的Tomato陰性細(xì)胞是和Sox-2抗體共染,說明篩選出的陰性細(xì)胞是非神經(jīng)細(xì)胞。3. RT-PCR的結(jié)果顯示,經(jīng)流氏篩選出的Tomato陽性細(xì)胞中Tuj-1的含量比Tomato陰性細(xì)胞中高出10倍多,而流氏篩選出的Tomato陰性細(xì)胞中Sox-2的含量比Tomato陽性細(xì)胞中高出300多倍。4.免疫熒光的結(jié)果顯示,經(jīng)3D培養(yǎng)后的螺旋神經(jīng)細(xì)胞存活率比2D培養(yǎng)條件下要高。5.免疫熒光的結(jié)果顯示,經(jīng)3D培養(yǎng)后的螺旋神經(jīng)細(xì)胞與2D培養(yǎng)條件下相比,雙極神經(jīng)元的細(xì)胞數(shù)比例升高,細(xì)胞的軸突長(zhǎng)度明顯增長(zhǎng),軸突分支也明顯增多。結(jié)論在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中,我們通過轉(zhuǎn)基因老鼠和流氏篩選得到了純化的螺旋神經(jīng)節(jié)的細(xì)胞。3D培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞與2D培養(yǎng)條件下相比,有更高的存活率,雙極螺旋神經(jīng)細(xì)胞的比例升高、細(xì)胞的軸突長(zhǎng)度明顯增長(zhǎng),軸突分支也明顯增多。
【圖文】：

利和氯沙坦的治療，在第６周聽力功能有部分修復(fù)（ｐ＜０．０５）。但是用藥組與正逡逑常組相比ＡＢＲ的闊值還是高的，ｆ邋＜０．０１，說明聽力的恢復(fù)是有限的。大鼠組和逡逑豚鼠組是相似的聽力變化趨勢(shì)。如圖１和圖２。逡逑邐邐—逡逑貨邋Ｒ｛Ａ＞逡逑９邐５邋ｊ邋Ｉ邋ｊ邋Ｉ邋ｊ邋ｙ邋Ｉ邋Ｉ邐ｆｉ邋ｔＳｗＴ＊邐５邐５邋Ｓ邋５邋ｉ邋ｓ邋Ｓ邋Ｈ邋ｉ邋５邋巧邋ｉｉ邋＆逡逑Ｃ邐Ｄａ邐邐，邐、逡逑ＣＤ邐＊邐逡逑復(fù)邐＾邐＊逡逑邐邐邐邋邋邋邋ｍ逡逑４0Ｒ（Ａ＞邋ｙ邐Ｖ邐ｓ邐４０．邐下逡逑４＼邋／／＾＾＂ＷＶ＼Ａ邋＾ａａ＾ａ廣邐ｆ邐Ｍｉ逡逑＼邐５邐＼邐＼邐５邋Ｉ邋Ｉ邋？邋ｉ邋ｉ邋ｎ？ｉ邋５Ｓ？￣邐0逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邐ＴＳ邋ｃａｐｔｏｐｒｉｌ＋ｌｏｓａｒｔａｎ逡逑圖１．卡托普利和氯沙坦聯(lián)用對(duì)豚鼠聽力的影響逡逑（Ａ）：正常組６周時(shí)ＡＢ民的闊值情況，約在１０祀左右；（Ｂ）：鼓室硬化組６逡逑周時(shí)在６０ｄＢ都沒有明顯的反應(yīng)；（Ｃ）：卡托普利和氯沙坦用藥組在３０邋ｄＢ己有逡逑明顯的反應(yīng)；（Ｄ）：顯示的是豚鼠王組的ＡＢＲ闊值變化情況，鼓室硬化組聽力逡逑明顯升高，用藥組有所降低，ｎ＝１９（正常組對(duì)照組），ｎ＝１７邋（鼓室硬化組），逡逑ｎ＝１９邋（卡托普利和氯沙坦用藥組）。＊ｐ＜０．０５

利和氯沙坦的治療，在第６周聽力功能有部分修復(fù)（ｐ＜０．０５）。但是用藥組與正逡逑常組相比ＡＢＲ的闊值還是高的，ｆ邋＜０．０１，說明聽力的恢復(fù)是有限的。大鼠組和逡逑豚鼠組是相似的聽力變化趨勢(shì)。如圖１和圖２。逡逑邐邐—逡逑貨邋Ｒ｛Ａ＞逡逑９邐５邋ｊ邋Ｉ邋ｊ邋Ｉ邋ｊ邋ｙ邋Ｉ邋Ｉ邐ｆｉ邋ｔＳｗＴ＊邐５邐５邋Ｓ邋５邋ｉ邋ｓ邋Ｓ邋Ｈ邋ｉ邋５邋巧邋ｉｉ邋＆逡逑Ｃ邐Ｄａ邐邐，邐、逡逑ＣＤ邐＊邐逡逑復(fù)邐＾邐＊逡逑邐邐邐邋邋邋邋ｍ逡逑４0Ｒ（Ａ＞邋ｙ邐Ｖ邐ｓ邐４０．邐下逡逑４＼邋／／＾＾＂ＷＶ＼Ａ邋＾ａａ＾ａ廣邐ｆ邐Ｍｉ逡逑＼邐５邐＼邐＼邐５邋Ｉ邋Ｉ邋？邋ｉ邋ｉ邋ｎ？ｉ邋５Ｓ？￣邐0逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邐ＴＳ邋ｃａｐｔｏｐｒｉｌ＋ｌｏｓａｒｔａｎ逡逑圖１．卡托普利和氯沙坦聯(lián)用對(duì)豚鼠聽力的影響逡逑（Ａ）：正常組６周時(shí)ＡＢ民的闊值情況，約在１０祀左右；（Ｂ）：鼓室硬化組６逡逑周時(shí)在６０ｄＢ都沒有明顯的反應(yīng)；（Ｃ）：卡托普利和氯沙坦用藥組在３０邋ｄＢ己有逡逑明顯的反應(yīng)；（Ｄ）：顯示的是豚鼠王組的ＡＢＲ闊值變化情況，鼓室硬化組聽力逡逑明顯升高，用藥組有所降低，ｎ＝１９（正常組對(duì)照組），，ｎ＝１７邋（鼓室硬化組），逡逑ｎ＝１９邋（卡托普利和氯沙坦用藥組）。＊ｐ＜０．０５
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R764.2

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本文編號(hào)：2542183