【摘要】：目的：探討髓樣細胞表達的激發(fā)受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1, TREM-1)在真菌性角膜炎中的表達及其作用的分子機制。方法：分別以真菌性角膜炎患者、真菌性角膜炎動物模型為對象研究TREM-1在機體中的表達規(guī)律；體外培養(yǎng)人角膜上皮細胞,研究TREM-1在真菌感染的人角膜上皮細胞中的表達和調控機制。實驗分為三部分：(1)選擇2012年9月至2013年10月在青島大學附屬醫(yī)院眼科就診的真菌性角膜炎初診患者25例(25眼)為患者實驗組,并根據角膜潰瘍炎癥反應程度再分為輕度炎癥組、中度炎癥組和重度炎癥組,收集角膜病灶周邊角膜上皮組織；制作角膜植片后剩余的周邊角膜的健康供體5例(5眼)為患者對照組,收集植片外圍角膜緣2mm內角膜上皮；RT-PCR檢測各組角膜上皮中TREM-1的表達及其與炎癥反應程度的關系。健康Wistar大鼠隨機分為空白對照組(角膜未予任何處理)、損傷對照組(刮除角膜上皮后僅覆蓋角膜接觸鏡,不接種真菌)和真菌感染組(刮除角膜上皮后覆蓋角膜接觸鏡,接種真菌),根據角膜感染程度進行評分；刮取各組角膜上皮行RT-PCR、Western blot檢測TREM-1的表達及其與角膜感染程度的關系；完整摘除角膜組織,免疫熒光染色檢測TREM-1在角膜中的定位表達。(2)體外培養(yǎng)人永生化角膜上皮細胞,分別加入煙曲霉菌菌絲刺激液、煙曲霉菌孢子刺激液,RT-PCR檢測不同時間點角膜上皮細胞中TREM-1的表達,篩選作用顯著的刺激液,Western blot檢測該刺激液對TREM-1蛋白表達的影響；RT-PCR檢測不同濃度LP17 (TREM-1選擇性抑制劑)預處理后煙曲霉菌刺激液誘導的角膜上皮細胞TREM-1表達改變以及TREM-1阻斷對煙曲霉菌刺激液誘導的角膜上皮細胞炎癥因子分泌的影響。(3)研究TREM-1與Toll樣受體-4(Toll like receptor-4, TLR-4)之間的協同作用,分別使用TREM-1抑制劑LP17、TLR-4抑制劑CLT-095和MyD88 (TLR信號通路下游因子)抑制劑ST2825預處理體外培養(yǎng)的人永生化角膜上皮細胞,Western blot檢測煙曲霉菌孢子刺激液誘導的TREM-1、TLR-4和MyD88蛋白表達；RT-PCR檢測分別/聯合抑制TREM-1、TLR-4對煙曲霉菌孢子刺激液誘導的角膜上皮細胞炎癥因子分泌的影響。結果：(1)與對照組相比,真菌性角膜炎患者輕度炎癥組、中度炎癥組和重度炎癥組中TREM-1 mRNA的表達均顯著升高,而且隨炎癥程度加重,TREM-1表達升高越明顯,各組之間差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。動物實驗中,真菌感染組8h起角膜上皮TREM-1 mRNA表達量較空白對照組不斷升高,48h達到高峰,各時間點之間差異具有高度統(tǒng)計學意義(P0.001)；16h起,真菌感染組角膜上皮中TRME-1 mRNA的表達量均明顯高于損傷對照組,差別有統(tǒng)計學意義(P0.001)；真菌感染組24h、48h角膜上皮TREM-1蛋白表達水平隨時間升高,且均明顯高于空白對照組(P0.05)；免疫熒光染色結果發(fā)現,空白對照組大鼠角膜TREM-1表達主要位于角膜上皮層,真菌感染組大鼠角膜TREM-1表達明顯升高,主要位于角膜上皮和角膜基質；真菌感染組大鼠角膜炎癥反應程度與角膜上皮中TREM-1表達水平呈正相關(r=0.942,P0.001)。(2)煙曲霉菌孢子刺激液刺激體外培養(yǎng)的角膜上皮細胞時,TREM-1表達升高較菌絲刺激液更加明顯,兩組差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；Western blot結果顯示,煙曲霉菌孢子刺激液加入細胞中4h,TREM-1蛋白表達升高,8hTREM-1蛋白表達達到高峰,各時間點與空白對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)；終濃度為lOng/ml、50ng/ml、100ng/ml的LP17均可抑制煙曲霉菌孢子刺激液誘導的角膜上皮細胞TREM-1 mRNA表達升高,抑制效果呈濃度依賴性,各濃度組之間TREM-1表達差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)；100ng/ml LP17能夠顯著抑制煙曲霉菌孢子刺激液誘導的角膜上皮細胞TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8分泌(P0.05)。(3)LP17能夠顯著抑制煙曲霉菌孢子刺激液誘導的角膜上皮細胞TREM-1、TLR-4和MyD88蛋白表達,CLI-095預處理也能夠部分阻斷煙曲霉菌孢子刺激液誘導的角膜上皮細胞TREM-1和TLR-4表達上調,此外ST2825同樣可以有效抑制TREM-1表達；LP17和CLI-095預處理均能不同程度的抑制TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8分泌,兩者對炎癥因子的抑制程度沒有明顯差別(P0.05),但兩種抑制劑聯合使用時各種炎癥因子的表達與單獨抑制組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論：(1)TREM-1介導的炎癥放大作用與真菌性角膜炎的炎癥反應進程密切相關；(2) TREM-1阻斷可以顯著抑制真菌感染后角膜上皮細胞炎癥因子的釋放,是抑制角膜炎癥反應的潛在靶點；(3)TREM-1與TLR-4在介導真菌感染后角膜上皮炎癥反應過程中具有協同促進作用；(4)真菌誘導的角膜上皮細胞TREM-1表達上調具有MyD88通路依賴性。
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R772.21

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