【摘要】：目的 1.觀察高糖培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)中玻連蛋白(vitronectin, VN)表達水平的改變,細胞微絲骨架結(jié)構(gòu)的變化,以及細胞遷移能力、成管能力的變化； 2.檢測VN表達水平改變對高糖培養(yǎng)下HUVEC中骨架結(jié)構(gòu)、細胞遷移、細胞成管能力的影響。 方法 第一部分： 建立高糖培養(yǎng)的HUVEC體外模型,并常規(guī)培養(yǎng)HUVEC作為正常對照,實驗分為組1(正常組：用含葡萄糖濃度為25mmol/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HUVEC)和組2(高糖組：用含葡萄糖濃度為50mmol/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HUVEC))。分別使用Western Blot檢測兩組中VN的蛋白表達情況,利用免疫熒光細胞化學(xué)染色結(jié)合熒光顯微鏡觀察兩組中細胞微絲骨架的變化,用劃痕法檢測細胞遷移能力的改變,Matrigel方法觀察細胞成管情況。利用獨立樣本t檢驗對組1和組2的數(shù)據(jù)進行分析。 第二部分： 高糖培養(yǎng)HUVEC,利用干擾RNA技術(shù)干擾VN的表達,實驗分為組2(高糖組：用含葡萄糖濃度為50mmol/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HUVEC))、組3(陰性干擾組：用control SiRNA預(yù)干擾HUVEC,再用含葡萄糖濃度為50mmol/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng))和組4(陽性干擾組：用VN SiRNA預(yù)干擾HUVEC,再用含葡萄糖濃度為50mmol/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng))。重復(fù)Western Blot實驗、免疫熒光實驗、劃痕實驗、Matrigel實驗。利用單因素方差分析中的LSD檢驗對組2、組3、組4的數(shù)據(jù)進行分析。 結(jié)果 第一部分： 1. Western Blot結(jié)果顯示,在分組培養(yǎng)的Oh時,組1和組2中的VN蛋白表達量分別是(1.098±0.085)、(1.091±0.068),兩組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t1，2=0.111,P，2，0.05)；在分組培養(yǎng)的24h時,組1和組2中VN的蛋白表達量分別為(0.893±0.119)(1.295±0.080)，兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t1，2=-4.857,P1，20.05)；48h時組1和組2中VN的蛋白表達量分別為(0.874±0.115)(1.724±0.098),兩組之間的差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(t，1，2=-9.710,P1，20.05)。 2.免疫熒光結(jié)果顯示,在24h和48h時,組2中都伴有更加明顯的細胞微絲骨架結(jié)構(gòu)的改變。 3.劃痕法表明,24h時組1和組2中遷移入劃痕的細胞數(shù)分別為(198.000±15.880)(242.000±11.130)個,兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t1，2=-5.495,P1，20.05)；48h時組1和組2中遷移入劃痕的細胞數(shù)分別為(293.000±8.681)(334.000±10.863)個,兩組之間的差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(t1，2=-7.193,P1，20.05)。 4. Matrigel法證實,6h時組2中形成的閉合管腔數(shù)目(120.000±9.813)多于組1(91.000±9.867),兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t1，2=-5.163,P1，20.05)；12h時組2中形成的閉合管腔數(shù)目(19.000±3.209)也多于組1(8.000±3.011),兩組之間的差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(t1，2=-5.659,P1，20.05)。 第二部分： 1. Western Blot結(jié)果顯示,高糖培養(yǎng)Oh時組2、組3、組4中的VN蛋白表達量分別為(1.091±0.068)(1.002±0.029)(1.104±0.144),三組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.064,P0.05)；高糖培養(yǎng)24h時組2、組3、組4中的VN蛋白表達量分別為(1.295±0.080)(1.078±0.090)(0.859±0.1150),三組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(LSD2,3=0.217,P2，，30.05；LSD2,4=0.435,P2，40.05；LSD3,4=0.219,P3，40.05)；48h時組2、組3、組4中的VN蛋白表達量也依次降低(1.724±0.098)(1.148±0.163)(0.693±0.167),三組之間的差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(LSD2,3=0.576,P2，30.05；LSD2,4=1.031,P2,40.05；LSD3,4=0.455,P3，40.05)。 2.免疫熒光結(jié)果顯示,24h時組2中的細胞微絲骨架結(jié)構(gòu)最為明顯,組3次之,組4最不顯著；48h時細胞微絲骨架分布亦然。 3.劃痕實驗表明,高糖培養(yǎng)24h時組2、組3、組4中遷移入劃痕的細胞數(shù)量依次減少(242.000±11.130)(199.000±7.055)(170.000±9.070),三組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(LSD2,3=42.833,P2，30.05；LSD2,4=71.333,P2，40.05；LSD3，4=28.500,P3，40.05)；48h時組2、組3、組4中遷移入劃痕的細胞數(shù)量分別為(334.000±10.863)(265.000±22.554)(227.000±12.613),三組之間的差異也均有統(tǒng)計學(xué)意義(LSD2,3=68.667,P2,30.05；LSD2,4==107.500,P2，40.05；LSD3，4=38.833,P3，40.05)。 4. Matrigel法檢測,高糖培養(yǎng)6h時組2、組3、組4中細胞形成的血管腔數(shù)目依次為(120.000±9.813)(88.000±6.976)(55.000±8.886),三組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(LSD2,3=3.283,P2，30.05；LSD2,4=6.567,P2,40.05；LSD3,4=3.283,P3.40.05)；12h時組2、組3、組4中細胞形成的血管腔數(shù)目也依次減少(19.000±3.209)(14.000±1.789)(8.000±3.578),三組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(LSD2,3=4.500,P2,30.05；LSD2，4=1.050,P2，40.05；LSD3，4=6.000,P3，40.05)。 結(jié)論 1.高糖可誘導(dǎo)HUVEC中VN表達增高,并伴有細胞骨架重塑、細胞遷移能力增加、細胞成管能力增強。 2.抑制VN的表達可導(dǎo)致高糖環(huán)境中HUVEC細胞骨架結(jié)構(gòu)改變、細胞遷移能力降低、細胞成管能力下降。 3.VN可能是糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)新生血管形成的一個重要影響因素。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R774

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本文編號：2529344