【摘要】：【目的】視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)的氧化損傷在年齡相關(guān)性黃斑變性(ARMD)的發(fā)病機制中起著核心作用。本研究旨在探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其重要的轉(zhuǎn)錄因子X盒結(jié)合蛋白1(XBP1)在丙烯醛引起的RPE氧化損傷中起到的作用,從而為闡明ARMD的發(fā)病機制提供思路�！痉椒ā坑�75μmol/L丙烯醛分別處理人視網(wǎng)膜色素上皮細胞系(ARPE-19)2~24 h,觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)及XBP1的表達。用XBP1 si RNA轉(zhuǎn)染細胞,下調(diào)XBP1蛋白水平,用Western blot檢測抗氧化基因Nrf2、SOD2在蛋白水平的表達;用DCF染色觀察細胞活性氧產(chǎn)物(ROS)的產(chǎn)生;用TUNEL染色觀察細胞凋亡改變。細胞用XBP1 si RNA或?qū)φ誷i RNA預(yù)處理后,加入丙烯醛,檢測RPE細胞的凋亡情況。7只XBP1~(flox/flox)小鼠,一眼視網(wǎng)膜下注射Cre腺病毒,對側(cè)眼視網(wǎng)膜下注射GFP腺病毒作對照。1周后取眼球。其中3只小鼠用TRIzol提取RPE的RNA,用實時RT-PCR法,檢測XBP1的下游基因ERdj4和p58IPK在RNA水平的表達。另4只小鼠眼球作視網(wǎng)膜冰凍切片,觀察腺病毒在視網(wǎng)膜下腔的表達,用免疫熒光染色法檢測XBP1以及抗氧化基因Nrf2和SOD2在RPE的表達�！窘Y(jié)果】丙烯醛分別處理RPE細胞2 h和4 h,GRP78的表達明顯增加。處理6 h XBP1蛋白激活。XBP1表達的下調(diào)伴有抗氧化基因Nrf2和SOD2表達的減少,細胞內(nèi)ROS的增加,并誘發(fā)細胞的凋亡。敲低XBP1以后丙烯醛對細胞的毒性作用明顯增加。通過視網(wǎng)膜下注射Cre腺病毒成功轉(zhuǎn)染XBP1~(flox/flox)小鼠RPE。與對照組相比,轉(zhuǎn)染Cre腺病毒的小鼠RPE內(nèi)的XBP1蛋白表達明顯減少,RPE內(nèi)的ERdj4和p58IPK RNA水平顯著下調(diào);抗氧化基因Nrf2和SOD2表達明顯減少�！窘Y(jié)論】丙烯醛作用于RPE細胞,激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及轉(zhuǎn)錄因子XBP1。抑制XBP1引起RPE內(nèi)抗氧化基因表達的減少,ROS的產(chǎn)生增加,并且增加丙烯醛的細胞毒性。XBP1參與RPE細胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激防御機制。
[Abstract]:[objective] oxidative damage of retinal pigment epithelial (RPE) plays a central role in the pathogenesis of age-related macular degeneration (ARMD). The purpose of this study was to investigate the role of endoplasmic reticulum stress and its important transcription factor X box binding protein 1 (XBP1) in the oxidative damage of RPE induced by acrolein, so as to provide a way to elucidate the pathogenesis of ARMD. [methods] Human retinal pigment epithelial cell line (ARPE-19) was treated with 75 渭 mol / L acrolein for 2 h, and the expression of endoplasmic reticulum stress protein glucose regulated protein 78 (GRP78) and XBP1 was observed. The XBP1 protein level was down-regulated by XBP1 si RNA, the expression of antioxidant gene Nrf2,SOD2 at protein level was detected by Western blot, the production of reactive oxygen species product (ROS) was observed by DCF staining, and the apoptosis was observed by TUNEL staining. After pretreatment with XBP1 si RNA or control si RNA, acrolein was added to detect the apoptosis of RPE cells. Seven XBP1~ (flox/flox) mice were injected with Creen adenoviruses subretinal in one eye and GFP adenoviruses were injected subretinal in the contralateral eyes as control. One week later, the eyeballs were taken. The RNA, extracted from RPE by TRIzol was used to detect the expression of downstream genes ERdj4 and p58IPK of XBP1 at RNA level by real-time RT-PCR. The expression of adenoviruses in the subretinal cavity was observed. The expression of XBP1 and antioxidant genes Nrf2 and SOD2 in RPE were detected by immunofluorescence staining. [results] the expression of GRP78 in RPE cells treated with acrolein for 2 h and 4 h was significantly increased. After 6 h treatment, the down-regulation of XBP1 protein expression was accompanied by the decrease of the expression of antioxidant genes Nrf2 and SOD2, the increase of intracellular ROS, and the apoptosis of XBP1 cells. The toxicity of acrolein to cells increased significantly after low XBP1. Successful transfer of XBP1~ (flox/flox) mouse RPE. by subretinal injection of Creenoviruses Compared with the control group, the expression of XBP1 protein in RPE was significantly decreased, the levels of ERdj4 and p58IPK RNA in RPE were significantly down-regulated, and the expression of antioxidant genes Nrf2 and SOD2 was significantly decreased. [conclusion] acrolein can activate endoplasmic reticulum stress and transcription factor XBP1. in RPE cells. [conclusion] acrolein acts on RPE cells and activates endoplasmic reticulum stress and transcription factor XBP1.. Inhibition of XBP1 decreased the expression of antioxidant genes in RPE, increased the production of ROS and increased the cytotoxicity of acrolein. XBP1 was involved in the intracellular antioxidant stress defense mechanism of RPE cells.
【作者單位】： 中山大學(xué)中山眼科中心//眼科學(xué)國家重點實驗室;西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院;美國俄克拉荷馬大學(xué)醫(yī)學(xué)院Harold
【基金】：國家自然科學(xué)基金青年項目(81200686) 高校博士學(xué)科點專項科研基金(20120171120108) 廣東省自然科學(xué)基金博士啟動項目(S2011040005378) 中山大學(xué)青年教師培育項目(11ykpy65)
【分類號】：R774

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本文編號：2513253