【摘要】：白內(nèi)障嚴重影響人類健康,是最常見的致盲原因之一。其中絕大部分是隨年齡增長所引起的老年性白內(nèi)障。目前國內(nèi)外治療老年性白內(nèi)障的方法仍集中于手術治療,缺乏有效的預防及早期治療藥物。因此,深入研究晶狀體渾濁的發(fā)生、發(fā)展機制,篩選有效的抗晶狀體渾濁藥物,尤其提倡從早期預防著手、盡力降低低齡患者的二次手術率,不僅能減輕患者痛苦,而且具有重要的社會、經(jīng)濟效益。哺乳動物晶狀體中的晶體蛋白,主要分為α、b、g三大類。此前,文獻研究大都集中在α族晶體蛋白類的研究,挖掘其“伴侶蛋白”對抗晶狀體渾濁的作用。但是,進一步研究發(fā)現(xiàn),βB2晶體蛋白的結構和功能均十分特殊,且在哺乳動物晶狀體中該蛋白成分含量最高,故其結構及水溶性成分的水平對于維持晶狀體的透明性和折射率至關重要。如能適度調(diào)控其表達,有望成為延緩晶狀體渾濁進程的有效手段。因此,βB2晶體蛋白更加適合作為年齡相關性晶狀體功能研究的靶蛋白。為此,探尋可調(diào)控βB2晶體蛋白表達的上游micro RNA,并明確其調(diào)控機制,從而實現(xiàn)調(diào)控βB2晶體蛋白在晶狀體中的表達量,進而延緩晶狀體渾濁的進程。Micro RNAs是一類非編碼單鏈小分子RNA,在胚胎發(fā)育、分化,細胞增殖、凋亡、代謝和適應環(huán)境壓力等進程的轉錄過程中起重要作用。研究表明miRNAs在眼部組織,包括角膜、脈絡膜小疣、視網(wǎng)膜、玻璃體、晶狀體和中均有特異性表達,并可能通過調(diào)控晶體蛋白的表達,參與晶狀體混濁的發(fā)生、發(fā)展過程。因此,探究特異性調(diào)控βB2晶體蛋白表達的miRNA,對老年性白內(nèi)障的早期預防和治療具有重要價值。本文探討miR-326在人晶狀體上皮細胞HLEC-B3中的功能及其調(diào)控Crybb2可能的分子機制,并驗證了miR-326在硒性白內(nèi)障模型大鼠晶狀體中的治療作用,為老年性白內(nèi)障的早期預防和治療提供了新途徑。我們首先通過數(shù)據(jù)庫的篩查和文獻閱讀,篩選出miR-326、miR-204-5p、miR-491-5p、miR-330-5p四個與βB2基因相關的miRNA。之后采用實時熒光定量PCR驗證了miR-326、miR-204-5p在βB2基因敲除(KO)小鼠晶狀體中的表達量與C57BL/6野生型(WT)小鼠相比明顯下調(diào)。其中,miR-326的表達差異最顯著,提示晶狀體中miR-326水平可能與Crybb2的表達有某種相關。隨后,我們在人晶狀體上皮細胞HLEC-B3中,用雙熒光素酶報告基因實驗證實miR-326的下游靶基因為FGF1。進一步實驗證實:在晶狀體上皮細胞中抑制miR-326的表達可促使FGF1的表達量增加,進而上調(diào)Crybb2的表達量,最終有助于抗晶狀體混濁的發(fā)生、發(fā)展。由此,初步闡明了在細胞中miR-326調(diào)控Crybb2的作用機制。此外,通過硒性白內(nèi)障模型大鼠晶狀體中的研究也支持上述結論。綜上所述,本實驗探尋出一條可以通過抑制晶狀體內(nèi)miR-326的表達,促使FGF1的表達、增加晶狀體內(nèi)βB2晶體蛋白表達量,從而有效延緩老年性白內(nèi)障的新途徑;并以此為基礎申報了國家發(fā)明專利;擬開發(fā)以miR-326為中心的新型抗晶狀體渾濁藥物,為老年性白內(nèi)障的“未病先防”提供理論及實驗依據(jù)。第一部分WT與Crybb2-/-小鼠晶狀體中miRNA的篩查目的:篩查與βB2具有靶向聯(lián)系,且在WT與Crybb2-/-小鼠晶狀體中表達差異較大的miRNA。方法:通過小鼠基因鑒定技術,鑒定WT、Crybb2-/-小鼠;通過Pic Tar、Sanger miRBase及Target Scan algorithms數(shù)據(jù)庫及通路分析篩選出與βB2基因之間存在靶向性關系的miRNA;采用q RT-PCR驗證上述候選靶基因在WT、Crybb2-/-小鼠晶狀體中的表達差異。結果:(1)挑選出四個與βB2之間存在靶向性關系的miRNA:miRNA-326、miR-204-5p、miR-330-5p、miR-491-5p;(2)通過q RT-PCR篩查發(fā)現(xiàn)miR-326、miR-204-5p在WT、Crybb2-/-小鼠晶狀體中表達差異顯著,尤其是miR-326的表達差異更為明顯。結論:miR-326可能通過某種途徑調(diào)控βB2晶體蛋白的表達�！康诙糠諱iR-326在晶狀體上皮細胞(HLEC-B3)中調(diào)控Crybb2表達的機制探究目的:探討miR-326通過何種通路影響下游基因、調(diào)控Crybb2表達。方法:(1)采取雙熒光素酶報告基因實驗,明確miR-326的下游靶基因;在HLEC-B3細胞分別轉染miR-326 agomir(模擬物)和antagomir(抑制體)72h后,采用western blot、免疫熒光技術檢測下游靶基因及Crybb2的表達情況;(2)在HLEC-B3細胞中分別轉染FGF1因子及sh FGF1,48h后采用western blot檢測Crybb2的表達變化;(3)在HLEC-B3細胞中分別轉染FGF1因子及sh FGF1,2h后兩組分別轉染miR-326 antagomir,培養(yǎng)72h后采用western blot分別比較上述FGF1因子組及sh FGF1組與陰性對照組中Crybb2表達的變化;(4)在HLEC-B3細胞中分別轉染miR-326 agomir和antagomir 48h后,采用200μM H2O2處理HLEC-B3細胞24h,誘導細胞凋亡,采用流式細胞儀觀察細胞凋亡率。結果:(1)實驗證實miR-326的下游靶基因為FGF1;(2)FGF1可以有效調(diào)控晶狀體上皮細胞中Crybb2的表達;(3)證實在HLEC-B3中抑制miR-326表達后FGF1的表達量上調(diào),最終使Crybb2高表達;反之,在HLEC-B3中增加miR-326的表達量后,FGF1的表達量下調(diào),最終降低Crybb2的表達;(4)在HLEC-B3中下調(diào)miR-326的表達量使FGF1表達上調(diào),可以抑制晶狀體上皮細胞的凋亡。結論:(1)miR-326通過與靶基因FGF1的3′-UTR結合而特異性抑制FGF1的表達,從而抑制Crybb2的表達;(2)在晶狀體上皮細胞中抑制miR-326的表達可以抑制其凋亡,進而與晶狀體渾濁的發(fā)生、發(fā)展相關。第三部分MiR-326在硒性白內(nèi)障模型大鼠晶狀體內(nèi)調(diào)控Crybb2表達并延緩白內(nèi)障進展的探究目的:探討miR-326在硒性白內(nèi)障模型鼠晶狀體內(nèi)調(diào)控Crybb2表達并延緩白內(nèi)障進展的作用。方法:9天齡SD大鼠皮下注射亞硒酸鈉溶液(25μmol/kg),構建亞硒酸鈉白內(nèi)障模型鼠;左眼為陰性對照,滴加miR-326 antagomir(抑制體)的陰性對照,右眼為治療眼,滴加miR-326抑制劑antagomir(抑制體),陰性對照與治療眼,每天早晚兩次滴藥,每次100μl,每天每只眼球共用藥1nmol,觀察白內(nèi)障渾濁進展;采用q RT-PCR檢測晶狀體內(nèi)藥物作用情況,并采用western blot技術檢測晶狀體內(nèi)FGF1、Crybb2的表達變化。結果:(1)硒性白內(nèi)障模型鼠眼滴miR-326 antagomir(抑制體)后,其晶狀體內(nèi)miR-326表達量下降,FGF1及Crybb2表達量升高。(2)滴加miR-326 antagomir(抑制體)的治療眼與陰性對照眼相比白內(nèi)障進程顯著減緩。結論:實驗證實在硒性白內(nèi)障模型鼠晶狀體內(nèi),通過miR-326的抑制劑antagomir靶向上調(diào)FGF1的表達,進而促進晶狀體內(nèi)Crybb2的表達,可以在一定程度上延緩白內(nèi)障的進展。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R776.1

【參考文獻】

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本文編號：2467338