【摘要】：研究背景 視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP)是一類以光感受器細(xì)胞進(jìn)行性功能障礙為特征,最終導(dǎo)致視覺障礙的一組進(jìn)行性遺傳性營養(yǎng)不良性退行病變,是世界范圍內(nèi)常見的致盲性眼病。臨床特點主要為進(jìn)行性視野缺失、夜盲、色素性視網(wǎng)膜病變和視網(wǎng)膜電圖異常。RP好發(fā)于少年和青壯年,患者在青壯年時期出現(xiàn)雙眼視力進(jìn)行性下降最終視力完全喪失,對患者和社會帶來極重的負(fù)擔(dān)。在中國,每年因視網(wǎng)膜變性疾病失明的患者近100萬,在白內(nèi)障、角膜病、玻璃體疾病等致盲性眼病已有完備的治療方案之后,目前還沒有阻止RP病變進(jìn)展和恢復(fù)視網(wǎng)膜功能的有效治療方法。盡管在過去的數(shù)十年間,人們對該病的治療進(jìn)行了各種嘗試,包括視網(wǎng)膜移植、基因治療、視覺假體、藥物干預(yù)等,但至今尚無確切有效、能重建視功能的治療方法。究其根本原因在于視網(wǎng)膜變性的病理機制極為復(fù)雜,在感光細(xì)胞喪失之后內(nèi)層神經(jīng)元也發(fā)生繼發(fā)變性,因此視功能的維持和重建存在巨大的障礙。那么,光感受器細(xì)胞的丟失對視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)細(xì)胞究竟產(chǎn)生了什么樣的影響,至今尚不完全清楚,本課題針對視網(wǎng)膜色素變性疾病中的內(nèi)層神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變構(gòu)進(jìn)行探究。 研究中,我們采用皇家外科學(xué)院大鼠(Royal College of Surgeons rat, RCS),這是一種遺傳性視網(wǎng)膜色素變性的經(jīng)典動物模型,該鼠的感光細(xì)胞進(jìn)行性變性。既往發(fā)現(xiàn)隨著變性的發(fā)展,視網(wǎng)膜整體電位水平下降,甚至呈熄滅狀態(tài),進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell, RGCs)的功能也受到嚴(yán)重影響,部分RGCs甚至不能產(chǎn)生動作電位的發(fā)放。那么,在視網(wǎng)膜變性中繼發(fā)感光細(xì)胞喪失之后,內(nèi)層的RGCs的密度分布、形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了什么樣的改變,以及鈣離子的流向在其中起了什么樣的作用,都有待深入探討。 此外另有研究表明在視網(wǎng)膜中存在一種非視覺圖像感光系統(tǒng),此系統(tǒng)由特殊的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞直接進(jìn)行感光,此類細(xì)胞含有特殊的感光色素melanopsin,稱之為感光神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Melanopsin-containing retinal ganglion cells, mRGCs),在缺乏視桿和視錐細(xì)胞的條件下仍對光線敏感,并且將非圖像視覺信號傳送到下丘腦的視交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN),參與生物節(jié)律的形成和瞳孔光反射等。這類細(xì)胞僅占神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞的1%-2%,廣泛分布于整個視網(wǎng)膜,構(gòu)成獨立的感光網(wǎng)絡(luò)。那么,在變性條件下,作為同樣位于視網(wǎng)膜內(nèi)層的神經(jīng)元,mRGCs的分布、細(xì)胞的形態(tài)、突起分支構(gòu)架以及分層,與周圍視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的聯(lián)系,究竟發(fā)生了什么樣的改變還不清楚。目前,關(guān)于視網(wǎng)膜色素變性過程中各級神經(jīng)元之間突觸結(jié)構(gòu)和功能“重構(gòu)”(remodeling)的機制已成為視網(wǎng)膜色素變性的病理機制研究中的熱點問題。有研究表明視網(wǎng)膜色素細(xì)胞、視桿細(xì)胞由于基因缺陷,或視網(wǎng)膜發(fā)生變性、損傷時,無功能輸入的視網(wǎng)膜神經(jīng)層會啟動一個“重構(gòu)”(remodeling)反應(yīng)。其特點為,上級神經(jīng)元發(fā)出軸索,其末梢形成微神經(jīng)瘤或異常突觸,造成視網(wǎng)膜回路重新連接；神經(jīng)元表面的分子表型喪失或被修改；muller細(xì)胞向外遷徙并形成視網(wǎng)膜下間隙纖維化,使殘存的視網(wǎng)膜無法從色素細(xì)胞和脈絡(luò)膜獲得營養(yǎng)因子和生存支持,光感受器細(xì)胞和神經(jīng)元逐漸死亡。那么mRGCs是否參與了重構(gòu),它的這種改變,對于視網(wǎng)膜變性中視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的保留、視覺功能的重建有什么樣的提示。 為此,本研究擬采用視網(wǎng)膜變性RCS大鼠,通過熒光金(Fluorogold)逆行標(biāo)記RGCs、抗nelanopsin抗體免疫熒光標(biāo)記mRGCs,激光共聚焦顯微鏡觀察神經(jīng)節(jié)細(xì)胞鈣離子成像及感光神經(jīng)節(jié)細(xì)胞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)的變化,初步探討視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)細(xì)胞繼發(fā)感光細(xì)胞變性死亡的可能機制。 目的 研究RCS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells, RGCs)分布、密度、細(xì)胞形態(tài),以及細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的變化,探討視網(wǎng)膜變性對RGCs的影響以及可能的觸發(fā)因素。 方法 采用視網(wǎng)膜變性RCS大鼠和正常對照大鼠,分為變性組和對照組。按生后21天(P21d)、60天(P60d)以及90天(P90d)分3個時間段,每時間點各6只大鼠,采用立體定位下行RCS大鼠上丘和外膝體Fluorogold逆行標(biāo)記RGCs,熒光顯微鏡下行視網(wǎng)膜鋪片觀察,研究RGCs在視網(wǎng)膜變性中的分布、形態(tài)和突起變化,以及密度改變。以及采用fluo-4AM孵育活體狀態(tài)下的視網(wǎng)膜鋪片和切片,行激光共聚焦觀察RGCs胞內(nèi)鈣成像,分析RGCs在變性過程中胞內(nèi)鈣濃度的變化。 結(jié)果 熒光標(biāo)記的RGCs分布于整個視網(wǎng)膜,沿神經(jīng)纖維走形分布,細(xì)胞胞體和突起清晰可見。RCS大鼠變性晚期RGCs胞體大小不一,細(xì)胞分布較稀疏,細(xì)胞突起分枝數(shù)和范圍減小,RCS大鼠RGCs密度P21d時為5400+109/mm2,P60d時4167+134/mm2,P90d時2807+161/mm2,隨著變性發(fā)展神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量顯著減少(F=536.463,P=0.000),與同組的Control大鼠統(tǒng)計學(xué)比較差異非常顯著(t60=24.172,t90=30.131,P=0.000),P60d時RCS大鼠存活的RGCs占同期Control大鼠的約80%,P90d時約占58%。變性晚期RCS大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞內(nèi)鈣呈高強表達(dá),表現(xiàn)為鈣超載現(xiàn)象,P60d、P90d時變性RCS大鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞內(nèi)鈣強度分別為335.0+20.8U/mrn2和420.2+43.0U/mm2與對照大鼠相比差異非常顯著(t60=-18.058,t90=-15.015,P=0.000),同時鈣熒光不僅表達(dá)在RGCs的胞體,也表達(dá)在樹突上,向內(nèi)叢狀層延伸。 結(jié)論 變性晚期RCS大鼠RGCs繼發(fā)感光細(xì)胞的喪失也發(fā)生變性死亡,細(xì)胞形態(tài)和分布密度受到顯著影響,RGCs胞內(nèi)鈣濃度的變化可能是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性、死亡的觸發(fā)因素：RCS大鼠變性晚期RGCs由于胞內(nèi)鈣的增加,激活一系列級聯(lián)反應(yīng),最終引起胞膜上受體和通道的改變,最終使得RGCs功能失活甚至變性死亡。因此我們推測,視網(wǎng)膜變性中RGCs胞內(nèi)鈣濃度的變化是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性、死亡的可能觸發(fā)因素。 目的 含]melanopsin的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可直接感光,并調(diào)制生物節(jié)律和瞳孔光反射等,探討此種特殊的感光細(xì)胞即感光神經(jīng)節(jié)細(xì)胞mRGCs,在視網(wǎng)膜變性疾病中的結(jié)構(gòu)改變和周圍視網(wǎng)膜神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的變構(gòu)。方法 采用經(jīng)典的視網(wǎng)膜變性動物模型RCS大鼠,及正常大鼠,分為變性組和對照組。按生后21天(P21d)、60天(P60d)以及90天(P90d)分3個時間段,每時間點各6只大鼠,實驗中行抗melanopsin免疫熒光染色,視網(wǎng)膜鋪片,激光共聚焦顯微鏡觀察,計算機分析nRGCs勺胞體形態(tài)、視網(wǎng)膜內(nèi)的分布、突起分支形態(tài)和分層。 結(jié)果 隨著感光細(xì)胞的丟失,RGCs也顯著減少,而mRGCs卻得以保留。視網(wǎng)膜變性RCS大鼠mRGCs的胞體形態(tài)、分布范圍和數(shù)量和正常對照大鼠相似。視網(wǎng)膜變性RCS大鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的感光神經(jīng)節(jié)細(xì)胞密度,P21d時148+10/mm2,P60d時135±8/mm2,P90d時136+17/mm2,不同階段差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.892,P=0.185)。而變性后期(P60d和P90d)mRGCs突起上melanopsin的表達(dá)明顯增強,樹突的網(wǎng)絡(luò)變密集,樹突分支明顯增多,樹突野范圍增大。 結(jié)論 隨著視網(wǎng)膜變性中感光細(xì)胞的丟失,mRGCs以乎更能耐受變性而更能得以保留,此外,mRGCs與周圍視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞之間的網(wǎng)絡(luò)連接提示內(nèi)層神經(jīng)視網(wǎng)膜在變性中發(fā)生了結(jié)構(gòu)的重建。提示在視網(wǎng)膜變性后視皮層神經(jīng)元保留了一定的突觸可塑性,以挽救視力的喪失。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R774.1

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4 鄭s，

本文編號：2463992